论文部分内容阅读
目的：.本研究在针刺大肠俞募穴治疗功能性便秘疗效肯定的基础上,探讨俞募穴治疗功能性便秘中EGC细胞及GDNF-P13K-Akt信号转导通路的作用,旨在探索针刺大肠俞募穴治疗该病的效应机制,以期为针刺治疗本病的临床选穴及应用提供科学依据。方法：1、实验一选昆明小鼠80只,随机分为以下5组：空白对照组、模型组、针刺组、药物组、空白针刺组,每组各16只。采用复方地芬诺酯灌胃法复制功能性便秘模型,选取双侧天枢、大肠俞交替针刺,每次电针治疗30min,1次/d,5次为一个疗程,疗程之间休息2d,共治疗2个疗程。分别于第1、2疗程结束后取胃、小肠和远端结肠,检测胃排空率、小肠推进率、结肠平滑肌张力变化幅度。2、实验二、三选昆明小鼠80只,随机分为以下5组：对照组、模型组、针刺组、EGC对照组、EGC针刺组,每组各16只。模型制作及电针操作同实验一。各组分别于第1、2疗程结束后取远端结肠,运用数字扫描显微镜、电镜、细胞凋亡技术观察结肠组织形态、平滑肌细胞超微结构、平滑肌细胞凋亡情况；利用免疫组化、原位杂交、PCR及Western Blot法检GDNF-PI3K-Akt信号通路及其下游mTOR蛋白的表达水平。结果：1、胃肠传输功能检测：(1)胃排空率模型组小鼠胃排空明显延迟(P<0.01),针刺和药物均可显著加快便秘小鼠的胃排空速度(P<0.01,P<0.01)；空白对照组与空白针刺组比较,两者胃排空率的差异无统计学意义(P>0.05)。第1、2疗程间进行比较,各组胃排空率差异无统计学意义(P>0.05)。(2)小肠推进率模型组小鼠小肠推进率明显减慢(P<0.01),针刺和药物均可显著加快便秘小鼠的小肠推进速度(P<0.01,P<0.01)；空白对照组与空白针刺组比较,两者小肠推进率的差异无统计学意义(P>0.05)。第1、2疗程间进行比较,各组小肠推进率差异无统计学意义(P>0.05)。(3)结肠平滑肌平均张力变化百分数模型组小鼠结肠平滑肌张力变化幅度呈降低趋势,但与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组比较,针刺可增强便秘小鼠的结肠平滑肌张力变化幅度(P<0.05)；空白对照组与空白针刺组比较,两者结肠平滑肌张力变化幅度百分数的差异无统计学意义(P>0.05)。第1、2疗程间比较,各组内结肠平滑肌张力变化不明显(P>0.05)。2、结肠组织形态学观察对照组结肠神经丛数量较多,内可见神经节细胞排列整齐均匀。模型组结肠神经丛数量减少,神经节细胞排列紊乱,内见空泡样变,细胞数量减少。针刺组结肠形态学与空白对照组比较无显著性改变。EGC对照组和EGC针刺组结肠组织形态改变与模型组相似,两者形态改变差别不明显。3、平滑肌细胞超微结构观察对照组平滑肌细胞染色质分布均匀,线粒体,粗面内质网,核糖体等结构清晰。模型组平滑肌细胞细胞核染色质聚集,线粒体明显肿胀,粗面内质网扩张。针刺组平滑肌细胞染色质分布均匀,胞浆中线粒体,粗面内质网,核糖体等结构清晰。EGC对照组和EGC针刺组比较,两者平滑肌细胞超微结构的变化不明显。4、平滑肌细胞凋亡检测与对照组比较,模型组凋亡细胞阳性表达率增强(P<0.01)；与模型组比较,针刺组凋亡细胞阳性表达率下降(P<0.01)；抑制EGC细胞后,针刺对平滑肌细胞凋亡的改善作用不明显(P>0.05)。第1、2疗程组内比较发现,各组随疗程变化均不明显(P>0.05)。5、GDNF-PI3K-Akt信号转导通路检测(1)GDNF蛋白的表达与对照组比较,模型组结肠内GDNF蛋白的表达水平显著降低(P<0.01)；与模型组比较,针刺组GDNF蛋白的含量升高(P<0.01)；抑制EGC后,针刺对GDNF蛋白表达水平的调节作用不明显(P>0.05)。第1、2疗程间进行比较发现,EGC针刺组2个疗程时GDNF蛋白的表达水平与1个疗程比较显著升高(P<0.05),其余组变化均不明显(P>0.05)。(2)Rai蛋白及其mRNA的表达与对照组比较,模型组结肠内Rai蛋白及其mRNA的表达水平降低(P<0.01,P<0.05)；与模型组比较,针刺组Rai蛋白及其mRNA的表达水平呈增强趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)；与EGC对照组比较,EGC针刺组结肠内Rai蛋白及其mRNA的表达增强(P<0.05,P<0.05)。第1、2疗程组内进行比较,对照组2个疗程时Rai蛋白的表达水平与1个疗程比较显著升高(P<0.01),其余组两者表达水平随疗程变化不明显(P>0.05,P>0.05)。(3)RET蛋白及其mRNA的表达与对照组比较,模型组结肠内RET蛋白及其mRNA的含量显著降低(P<0.01,P<0.01)；与模型组比较,针刺组两者的表达水平增强(P<0.01)：与EGC对照组比较,EGC针刺组结肠内RET蛋白及其mRNA的表达水平变化不明显(P>0.05,P>0.05)。第1、2疗程组内比较发现,各组内两者的表达水平变化均不明显(P>0.05,P>0.05)。(4) PI3K、Akt表达水平与对照组比较,模型组结肠内PI3K、Akt的含量升高(P<0.01)；与模型组比较,针刺组Akt的表达水平降低(P<0.05),PI3K的表达水平呈下降趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。EGC对照组与EGC针刺组比较,两组PI3K、Akt的表达水平变化均不明显(P>0.05,P>0.05)。第1、2疗程组内比较发现,各组PI3K、Akt的表达水平变化均不明显(P>0.05,P>0.05)。(5)mTOR蛋白的表达与对照组比较,模型组结肠内mTOR蛋白的含量升高(P<0.01)；针刺可抑制结肠内mTOR的表达,但与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)；EGC对照组与EGC针刺组比较,mTOR表达水平的变化不明显(P>0.05)。第1、2疗程组内比较发现,各组mTOR的表达水平变化均不明显(P>0.05)。结论：1、在健康状态下,针刺大肠俞募穴对胃肠传输功能的改善作用不明显。2、在疾病状态下,针刺大肠俞募穴可能通过促使EGC分泌产生GDNF,调控PI3K-Akt信号通路,下调mTOR的表达,抑制细胞凋亡,进而改善结肠组织形态及胃肠传输功能,治疗功能性便秘。3、抑制EGC后,针刺大肠俞募穴对结肠组织形态、GDNF-PI3K-Akt信号通路表达水平的调控作用不明显。从反面证实了EGC细胞在针刺大肠俞募穴治疗功能性便秘中的重要作用。