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研究背景和目的慢性病毒性肝炎是一种严重危害人类健康的常见病、多发病,疾病后期可发展为肝硬化、肝癌,严重危害人类健康。近来肝脏影像学及病理检查发现,部分慢性病毒性肝炎患者伴有脂肪变性,甚至高达50-72%的HCV感染者出现脂肪肝。肝脂肪变性对于慢性病毒性肝炎患者肝纤维化进展和抗病毒疗效均产生重要影响。动物模型己经为人类研究疾病做出了巨大贡献,建立各种疾病动物模型,现已被视为研究发病机制以及探讨相应治疗方法的重要手段。但目前尚缺乏理想的实验动物模型来阐明慢性病毒性肝炎诱发肝脂肪变性的具体的发病机制,从而使得对其防治的研究受到很大的局限。目前已建立的慢性病毒性肝炎实验动物模型存在体内缺乏病原体复制、与临床情况显著不同等局限性,目前尚未见慢性病毒性肝炎继发肝脂肪变性的动物模型的报道。小鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus,MHV)最早于1949年被发现,属于冠状病毒,是一类RNA病毒,可以导致肝脏和中枢系统的疾病和广泛的免疫功能障碍。其中,MHV-A59型病毒由于其不易感染人,同时具有嗜肝性与嗜神经组织性,一般用来复制神经脱髓鞘疾病与爆发型肝炎模型,由于国内对MHV-A59在细胞模型的建立及小鼠感染品种与剂量有了一定的研究基础,本课题所采用小鼠肝炎病毒MHV-A59作为生物致病因子,建立小鼠慢性病毒性肝炎诱发肝脂肪变性的动物模型,为进一步在体内研究慢性病毒性肝炎诱发肝脂肪变性的相关机制提供适宜的动物模型和理论基础。研究方法选用6-7周龄的SPF级C57BL/6小鼠。制备MHV-A59病毒液,将制备的MHV-A59病毒液按10-3、10-4、10-5、10-6、10-7浓度稀释。C57BL/6小鼠30只随机分为5个浓度组(每组6只小鼠)。5种浓度病毒液分别感染5组小鼠,每只小鼠腹腔注射0.5ml。连续观察2周,记录生存小鼠,按照Reed-Muench法计算病毒半致死剂量(LDso),确定实验中所需病毒的适宜剂量。随后取C57BL/6小鼠120只随机分为4组：①对照组(以普通饲料喂养)；②高脂组(以高脂饲料喂养)；③病毒组(感染MHV-A59,以普通饲料喂养)；④高脂病毒组(感染MHV-A59,以高脂饲料喂养),高脂饲料配方为：87.6%普通饲料+2%胆固醇+10%猪油+0.4%胆酸钠。分别于造模第1天和第30天按10-6病毒浓度0.5m1腹腔注射MHV-A59病毒,每周动态监测小鼠一般状况和体质量,于造模后第13周末处死小鼠,取血清检测MHV抗体(ELISA法)、血清脂质和转氨酶(湿化学法)；小鼠肝脏冰冻切片进行油红O染色,石蜡切片进行HE染色。研究结果1、小鼠MHV-A59病毒感染后1-2d开始出现病毒感染症状,死亡高峰出现在第3-5d,按Reed-Mueneh公式计算LDso=10-5.5,故选用10-6的病毒浓度进行实验。2、小鼠一般状况和体质量变化结果：MHV-A59病毒感染导致小鼠食欲下降和体质量降低,而高脂饮食合并病毒感染更加重小鼠食欲下降和体质量降低。3、小鼠血清MHV抗体检测结果显示：高脂病毒组和病毒组小鼠血清MHV抗体强阳性,对照组和高脂组阴性。4、小鼠血清脂质水平变化结果显示：各组间TG与HDL-C水平无差异；与对照组相比,高脂组和高脂病毒组的TC水平增高,差异显著(P<0.05),病毒组的TC水平也高于对照组,但差异不显著；与对照组相比,高脂组和高脂病毒组的LDL-C水平增高,差异显著(P<0.01),高脂病毒组LDL-C水平高于高脂组(P<0.05)。5、小鼠转氨酶水平变化结果：与对照组相比,其余3组的ALT和AST水平均显著增高(P<0.01)。6、小鼠肝脏HE染色结果：对照组小鼠肝细胞索以中央静脉为中心向四周呈放射状排列,肝小叶结构清晰,细胞间紧密联系；肝细胞核大而圆,核仁明显,胞质均匀丰富；汇管区无炎性浸润。高脂组小鼠肝小叶结构尚清晰,肝细胞肿胀、胞质疏松呈现空泡状改变(肝细胞脂肪变性),少见炎症细胞浸润。病毒组及高脂病毒组小鼠肝小叶结构稍紊乱,可见不同程度的肝细胞肿胀、胞质疏松,胞质空泡状改变；可见灶性坏死、碎片样坏死甚至桥接坏死,汇管区淋巴细胞浸润；高脂病毒组肝细胞还可见气球样变(肝细胞脂肪变性)。7、小鼠肝组织冰冻切片油红O染色结果：对照组小鼠肝细胞核呈蓝色,细胞质内无红染物质；高脂组肝细胞内存在弥漫性较粗大的红染脂滴；病毒组肝细胞内脂滴比高脂组少而细小；高脂病毒组肝细胞内脂滴比高脂组更密集且更粗大。用Motic Med专业医学图像软件分析油红O染色图像,计算肝脏脂肪含量,与对照组相比,病毒组、高脂组、高脂病毒组的肝脏脂肪含量百分比均显著增高；高脂病毒组肝脏脂肪含量百分比显著高于高脂组。结论本研究利用小鼠肝炎病毒MHV-A59感染C57BL/6小鼠,建立了慢性病毒性肝炎继发肝脂肪变性的动物模型,各项指标与人体疾病的变化基本一致,为进一步研究慢性病毒性肝炎继发肝脂肪变性的机制和药物筛选提供了较为适宜的动物模型和理论基础,具有重要的现实意义。