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植物细胞壁关联蛋白激酶(Wall-associated kinase, WAK)是一类特殊的类受体蛋白激酶(Receptor-like kinases, RLKs),它的结构特殊,由三部分组成：分别为胞外域、跨膜域和一个具有丝／苏氨酸激酶活性的胞内域；其中胞外域可通过与细胞壁成分果胶共价交联感知细胞壁变化,胞内域具有激酶活性可以将胞外信号通过磷酸化的方式进行传送,为WAK跨膜传递信号提供了分子基础。研究显示WAK在多种植物中被发现,分布广泛,其基因在植物体内的表达具有特异性,能受到特定因素的诱导。高等植物的基因调控主要是在转录水平上进行的,基因上游的启动子序列包含了多种顺式作用元件和核心元件,研究植物基因的启动子是研究特定基因表达特点和转录调控机制的关键。本研究通过PCR技术成功从水稻基因组DNA中分离获得细胞壁关联蛋白激酶(OsWAK11)基因上游启动子序列,长度为974bp(946/+28),将其命名为OsWAKpro.通过软件分析发现,OsWAKpro序列包含了重要的顺式作用元件以及启动子基本元件,分别为TATA-box、CAAT-box、I-box和W-box一系列启动子核心元件,以及铜响应调控元件(CuRE),茉莉酸甲酯(MeJA)相关元件,热激蛋白调控元件(HSE)和脱落酸调控元件(ABRE)以上参与植物对于外界环境响应的元件。为进一步研究WAK启动子对下游基因的调控作用,本研究利用克隆获得的OsWAKpro片段构建了连接GUS报告基因的植物表达载体pBI121-OsWAKpro-GUS,通过农杆菌介导法获得了转基因烟草。对转基因烟草进行GUS组织化学染色,结果发现OsWAKpro的表达具有组织特异性,主要在转基因烟草地上部表达,在根系中不表达。地上部主要在真叶(叶脉),子叶,茎以及茎的木质部,髓,以及形成层细胞中表达,OsWAKpro在成熟花的柱头和子房处也有强烈表达。此外还发现机械损伤强烈诱导OsWAKpro的特异性表达。已有研究发现WAK基因在水稻中受到一些特定金属离子的诱导表达,为进一步研究OsWAKpro在植物体内对于金属胁迫的响应情况,本实验对转基因烟草进行了铜、铝、钠三种金属离子处理,结果显示3种金属都能诱导OsWAKpro的高度表达。其中GUS蛋白活性最高的是铜处理植株,为对照的6.4倍；其次为铝处理(3倍)；钠处理下GUS活性为对照的2.1倍。而对转基因烟草进行不同浓度的金属盐溶液处理,随着铝浓度升高至100μmol·L-1,转OsWAKpro烟草体内的GUS蛋白活性相应上升,而AL3+浓度继续上升至200 μmol·L-1时,GUS活性有所下降；在0-10μmol·L-1Cu2+处理下,GUS蛋白活性随Cu2+处理浓度的提高而上升,当Cu2+处理浓度提高至20μmol·L-1时,GUS蛋白活性开始下降,但仍显著高于未处理对照。而当NaCl浓度为50μmol·L-1时,GUS活性显著高于其他处理浓度。一氧化氮供体硝普钠(SNP)和抗病相关信号分子水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)同样能诱导OsWAKpro表达,其中SNP处理后转OsWAKpro植株体内GUS活性显著高于未处理对照,而MeJA和SA处理下植株GUS活性在数值上略高于未处理组,但无显著差异。本实验利用Omnia(/) Ser/Thr-Peptide Kit试剂盒测定经纯化的OsWAK激酶域融合蛋白的体外激酶活性。结果显示,OsWAK激酶域融合蛋白浓度为87.5 μmol·L-1,在30℃下,1.0mmol·L-1 ATP,0.2 mmol·L-1 DTT,10 μmol·L-1 Ser/Thr-Peptide的反应体系中检测得具有激酶活性,在反应开始24 min之后10 μmol·L-1底物的磷酸化水平达到饱和。分析OsWAK蛋白米氏常量(Km)和最大反应速率(Vm),结果表明WAK蛋白体外具有激酶活性,Km=3.58μmol·L-1, Vmax=0.30μmol·min-1·μg-1。