在临床治疗中,多药耐药的产生是化疗失败和肿瘤复发的最主要因素。肿瘤多药耐药产生的分子机制相对复杂,其中ATP结合盒转运蛋白超家族(ABC家族)在肿瘤组织中高表达被认为是引起肿瘤多药耐药的主要原因。ABCB1(也称为P-glycoprotein)是ABC转运蛋白家族主要成员,已被发现在多种肿瘤组织高表达,如结肠癌、肝癌、前列腺癌等。ABCB1可以识别多种抗肿瘤化疗药物,如紫杉醇、喜树碱类、蒽环霉素等,利用ATP水解释放的能量,将其泵出肿瘤细胞外,使其在细胞内的浓度下降,进而导致化疗药物功效减弱甚至消失,最终产生多药耐药。将ABCB1抑制剂与传统化疗药物联用,降低ABCB1的表达或者活性,增加抗肿瘤药物在耐药细胞中的浓度,被认为是临床上克服ABCB1介导的多药耐药非常有前景的策略。目前为止,现有的ABCB1抑制剂由于选择性差、药物相互作用及安全性等问题,限制了其临床应用,因此,发现一种高效低毒、选择性强的新型ABCB1抑制剂一直是解决肿瘤耐药问题的研究热点。本课题发现了三个系列的新型嘧啶类耐药逆转剂,对于ABCB1介导的肿瘤耐药性具有不同程度的耐药逆转活性,并对其耐药逆转机制进行研究。本课题的研究结果和主要发现包括:(1)含1,2,3-三氮唑结构单元的嘧啶类衍生物对ABCB1介导的肿瘤耐药性的逆转作用及其机制研究(系列一)通过对课题组内的小分子化合物库中约500个化合物进行初步筛选,发现含有1,2,3-三氮唑以及嘧啶结构单元的小分子化合物,能够不同程度地逆转ABCB1高表达结肠癌耐药细胞株SW620/AD300对紫杉醇的耐药性。同时文献报道,含有嘧啶母核的酪氨酸激酶抑制剂(TKIs),如吉非替尼和厄洛替尼,也是ABCB1以及其他ABC转运蛋白的抑制剂;且1,2,3-三氮唑结构单元也普遍应用在ABCB1抑制剂的设计合成中。基于筛选发现和文献支持,结合分子拼合原理,最终发现了一类含1,2,3-三氮唑结构单元的嘧啶类新型耐药逆转剂(系列一)并对其耐药逆转机制进行研究。结果表明,系列一化合物对结肠癌耐药细胞株SW620/AD300具有不同程度的耐药逆转活性,其中化合物15,17,25,34,36的逆转活性明显优于ABCB1抑制剂Verapamil。构效关系分析发现1,2,3-三氮唑结构单元的引入对化合物逆转耐药活性的提升起到了重要作用。其中逆转活性最好的化合物25对结肠癌耐药细胞株SW620/AD300中ABCB1转运蛋白的表达和细胞定位没有影响,而是通过抑制ABCB1转运蛋白的功能,增加紫杉醇在耐药细胞中的蓄积量,使其达到细胞毒有效浓度,发挥抗肿瘤作用。(2)含双酰胺、1,2,3-三氮唑结构单元的嘧啶类衍生物对ABCB1介导的肿瘤耐药性的逆转作用及其机制研究(系列二)在对化合物结构的进一步优化中,基于系列一的结构基础,我们一方面保留了对ABCB1抑制活性影响明显的官能团,如1,2,3-三氮唑结构单元、卤素基团、芳环基团、正电子基团等;另一方面引入具有潜在增强ABCB1抑制活性的芳环、双酰胺结构单元,最终筛选得到一类含双酰胺、1,2,3-三氮唑结构单元的嘧啶类衍生物(系列二)。相对于系列一,系列二化合物的耐药逆转活性并没有得到提高,反而呈现下降的趋势。分子对接结果确认了双酰胺结构单元的加入的确增加了化合物与ABCB1转运蛋白的氢键结合位点。另有研究表明,化合物的脂溶性对其能否结合于ABCB1转运蛋白的疏水性药物结合口袋至关重要,因此我们对比了两个系列中的四组化合物(系列一化合物34,35,36,38与系列二化合物10,11,12,13)的脂溶性,结果显示,系列二化合物10,11,12,13的脂溶性降低。综合以上结果,我们推测虽然双酰胺结构单元的加入增强了化合物与ABCB1的氢键相互作用,然而也导致化合物尺寸偏大,使部分官能团暴露在溶剂区,脂溶性下降,降低了与ABCB1蛋白的疏水性药物结合口袋的结合强度,最终导致活性下降。这为我们进一步优化化合物结构,提升逆转活性提供了方向。(3)含双酰胺结构单元的嘧啶类衍生物对ABCB1介导的肿瘤耐药性的逆转作用及其机制研究(系列三)基于系列二的研究结果,我们去掉1,2,3-三氮唑结构单元以缩短分子尺寸,筛选得到一类含双酰胺结构单元的嘧啶类衍生物(系列三),并且对其耐药逆转活性进行评价。实验结果表明系列三化合物的耐药逆转活性整体上明显优于前两个系列化合物,且系列三中化合物15,18,19,12对比于系列二中化合物27-29、34脂溶性也得到了提高,证实了脂溶性对提高化合物逆转活性的重要性。我们选择逆转活性最好的化合物19做进一步的机制研究。结果表明化合物19同样不影响结肠癌耐药细胞株SW620/AD300中ABCB1转运蛋白的表达和细胞定位,而是通过抑制ABCB1转运蛋白的功能,增加紫杉醇在耐药细胞中的蓄积量,使其达到细胞毒有效浓度,发挥抗肿瘤作用;通过ATPase活性实验推测化合物19是一个ABCB1底物竞争性抑制剂,通过与紫杉醇竞争结合于ABCB1的药物结合口袋,增加紫杉醇的细胞内浓度,从而逆转耐药;化合物19对CYP3A4(细胞色素P450 3A4)没有明显的抑制活性,表明该化合物可以做为一个安全有效的先导化合物;体内实验结果证明化合物19也能够在体内发挥耐药逆转活性,且毒副作用小,具有良好的应用前景。总之,结合分子拼合原理,经过多轮优化筛选,最终发现了三个系列的新型嘧啶类耐药逆转剂,能够在不同程度上逆转ABCB1高表达结肠癌耐药细胞株SW620/AD300对紫杉醇的耐药性,极大地丰富了现有化学逆转剂的结构类型,为进一步研发更加安全有效的耐药逆转剂提供了结构基础,具有重要意义。