高同型半胱氨酸血症(HHcy)是心血管疾病的独立危险因素之一。大量的临床研究以及流行病学调查表明高同型半胱氨酸血症与心血管疾病发病率密切相关。Meta分析也发现血清同型半胱氨酸(Hcy)每增加5μmol/L,罹患心血管疾病风险增加1.6-1.8倍。HHcy可以抑制内皮细胞生长和内皮损伤后的再内皮化,损害内皮的舒张功能,并能加速血管内膜的增生,同时促进平滑肌细胞增生。我们知道,在各种病理状态下,血管再生的过程都参与其中。血管再生是一种不同于血管发育的,在病理条件下受严格调控的血管生成,但Hcy如何影响血管再生的机制并不清楚。本课题我们研究高同型半胱氨酸血症对血管再生的影响及机制。第一部分：高同型半胱氨酸抑制血管再生目的：运用多种经典血管再生模型观察高同型半胱氨酸血症对血管再生的影响。方法：1、选用转基因Tg-hCBS+Cbs+/--/-小鼠(Kruger实验室,费城,宾夕法尼亚),由于其胱硫醚p合成酶(CBS, cystathionine-β-synthase)缺乏,致使同型半胱氨酸代谢中转硫基途径受阻,血清同型半胱氨酸水平自发上升,一般可达到重度高同型半胱氨酸血症(血清同型半胱氨酸>115μmol/L)。乳鼠出生10日之内进行基因测定。2、运用多种经典血管再生模型,观察小鼠血管再生。2.1眼球视网膜血管染色：选取出生后1天,3天,7天,14天乳鼠及8-12周成年雄性小鼠,处死后摘取眼球,分离视网膜,免疫荧光染色视网膜血管内皮细胞(Isolectin B4染色),激光共聚焦显微镜下逐层扫描,重组3D图像,每个样本选取3个层面计数视网膜血管网长度总和,比较对照组与高同型半胱氨酸血症小鼠视网膜血管密度及长度。2.2主动脉环微血管生成(Aortic ring assay)。分离小鼠主动脉(长约10mm),清理干净周围脂肪组织及血液,切成多个约1mun长度血管环,种植于基质胶(Matrigel)上,每日拍照并计数微血管生长。结果：1、高同型半胱氨酸血症抑制乳鼠的视网膜血管的生长,同时成年小鼠的视网膜血管网血管再生也受到抑制(p<0.05)。2、高同型半胱氨酸抑制小鼠主动脉环微血管生成。在主动脉环接种于基质胶的第5天,可以观察到高同型半胱氨酸血症组(hCBS+Cbs-/-小鼠)的主动脉环微血管生成受抑制。主动脉环微血管生成同时呈现了同型半胱氨酸浓度依赖性,随着浓度升高,微血管生长抑制加强。结论：高同型半胱氨酸血症小鼠血管再生受抑制。第二部分：高同型半胱氨酸血症致使肝细胞生长因子(HGF)释放减少从而抑制血管再生目的：探讨高同型半胱氨酸抑制血管再生的分子机制方法：1、小管形成(Tube formation)。选取人主动脉内皮细胞(HAEC)以及人微小血管内皮细胞(HMVEC-C),传代至第8代后,分别使用不同浓度DL-Hcy(100/200/500μm)处理细胞24小时。基质胶(Matrigel)预先铺板(96孔板),胰酶消化细胞后,种植于基质胶(Matrigel)上,8小时后观察小管形成情况,计数小管形成个数及长度；2、血管再生基因RT2ProfilerTMPCR筛查。此PCR基因筛查试剂盒包含血管再生过程中的84个主要基因,其中包括生长因子及其受体,趋化因子和细胞因子,粘附因子,蛋白酶以及抑制剂和转录因子等。提取来自对照组以及Hcy处理组的人主动脉内皮细胞(HAEC)总RNA,Real-time PCR检测基因表达,确定有意义的上调或下调基因。3、Real-Time PCR。以筛选出的肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)为目标基因,提取HAEC/’小鼠主动脉/小鼠心脏组织总RNA,样本分别来自细胞对照组和Hcy处理组以及8-12周龄对照组小鼠(hCBS+Cbs+/-小鼠)和高同型半胱氨酸血症组小鼠(hCBS+Cbs-/-小鼠),设计HGF基因引物,检验HGF基因表达水平在两组间的差异。4、Western blot,提取HAEC/(?)、鼠主动脉/小鼠心脏组织总蛋白,样本分别来自细胞对照组和Hcy处理组以及8-12周龄对照组小鼠(hCBS+Cbs+/-小鼠)和高同型半胱氨酸血症组小鼠(hCBS+Cbs-/-小鼠),Western blot检验HGF蛋白表达水平在两组间的差异。5、建立小鼠急性心肌梗死模型。结扎小鼠左冠状动脉,建立急性心肌梗死模型。手术2周后,处死小鼠,收集心脏组织,提取心脏总蛋白,测定组织中HGF蛋白表达水平。6、酶联免疫吸附试验(ELISA)测定小鼠血清HGF水平。外周血血清样本收集自8-12周龄hCBS+Cbs+/-小鼠和hCBS+Cbs-/-小鼠,使用HGF ELISA试剂盒,酶标仪450nm波长下测定吸光度,计算样品浓度,同时收集心肌梗死2周后小鼠血清样本,测定HGF水平。7、加入HGF改善Hcy抑制的小管形成,主动脉环微血管生成。运用小管形成及主动脉环微血管模型,加入不同浓度外源性人工合成HGF (50/100/150ng/ml),观察其能否逆转Hcy抑制的小管形成以及主动脉环微血管形成(实验与观察方法同前)。结果：1、Hcy抑制小管形成。经DL-Hcy (100/200/500μm)处理(24h)后的HAEC以及HMVEC-C,小管长度以及小管数量明显减少,并呈浓度依赖性,具有统计学意义。2、血管再生基因RT2ProfilerTMPCR筛查(设定以4倍变化为有统计学意义)。比较对照组与Hcy处理组,在84个主要基因中,Collagen, type IV, alpha3(COL4A3); Epiregulin(EREG); Hepatocyte growth factor (HGF), Interferon(IFNB1&IFNG), and Leukocyte cell derived chemotaxin1(LECT1)均显著下调。其中Hepatocyte growth factor (HGF)下调最为显著,为20倍下调。3、Hcy下调HAEC/小鼠主动脉/小鼠心脏组织肝细胞生长因子HGF mRNA及蛋白表达水平。4、HGF在高同型半胱氨酸血症小鼠心肌梗死组织中的蛋白表达水平下降。提取心肌梗死后2周的心脏组织,同型半胱氨酸血症组相较于对照组HGF蛋白表达水平明显下降,*P<0.05vs hCBS+Cbs+/-+MI(n=6).5、血清HGF水平在高同型半胱氨酸血症小鼠中降低。ELISA结果表明,高同型半胱氨酸血症小鼠的外周血血清HGF水平显著低于对照组(*P<0.05vshCBS+Cbs+/-(n=8)),并且心肌梗死后2周高同型半胱氨酸血症小鼠的外周血血清HGF水平也显著低于对照组。6、人工合成外源性HGF能显著改善Hcy抑制的小管形成以及主动脉环微血管生成。其结果具有统计学意义。外源性人工合成HGF的浓度达到100ng/ml时,开始逆转Hcy的抑制作用,当浓度达到150ng/ml时修复作用加强。结论：Hcy通过抑制肝细胞生长因子(HGF)的生成与分泌从而抑制血管再生第三部分：高同型半胱氨酸抑制小鼠心肌梗死后血管再生的内皮祖细胞机制目的：探讨内皮祖细胞参与的高同型半胱氨酸血症小鼠心肌梗死后的血管再生方法：1、测定高同型半胱氨酸血症小鼠心肌梗死后血管再生情况。1.1小动物超声心动图常规评价8-12周龄hCBS+Cbs+/-小鼠与hCBS+Cbs-/-小鼠心功能,并取小鼠心脏切片,分别染色后计数心脏毛细血管密度；1.2建立小鼠心肌梗死模型(Under the help of Dr.Gao)。结扎小鼠左冠状动脉,建立急性心肌梗死模型(Myocardial infarction, MI),观察心肌梗死小鼠6周后生存率,超声心动图观测两个实验组hCBS+Cbs+/-+MI组与hCBS+Cbs-/-+MI组的心脏左室舒张末径(LVEDD),左室收缩末径(LVESD),左室壁和室间隔厚度,计算左室射血分数(LVEF);1.3心肌梗死第2周及第6周末,处死小鼠后,取心脏,冰冻切片,行HE染色,TTC染色,观察形态学差别；CD31(内皮细胞)染色,计数心脏毛细血管密度；TUNEL染色,计数心肌梗死后细胞凋亡情况。2、流式细胞仪检测内皮祖细胞(Endothelial progenitor cell, EPC):流式细胞仪检测干细胞抗原-1(Sca-1+)以及血管生长因子受体-2(VEGFR-2+)均为阳性的细胞为内皮祖细胞(EPC),同时检测小鼠外周血源性(PB)EPC以及骨髓源性(BM)EPC比例；2.1比较8-12周龄hCBS+Cbs+/-小鼠与hCBS+Cbs-/-小鼠之间外周血(PB)源性／骨髓(BM)源性内皮祖细胞比例以及内皮祖细胞死亡率(violet dead cell染色)；2.2比较在hCBS+Cbs+/-+MI与hCBS+Cbs-/-+MI组之间,小鼠心肌梗死后2周及6周PB/BM的EPC比例以及细胞死亡率。3、骨髓源性Sca-1+细胞静脉注射治疗,对于小鼠心肌梗死后血管再生修复的作用。3.1骨髓源性Sca-1+细胞的分离。选用绿色荧光蛋白转基因工具小鼠(C57BL/6-gfp小鼠),鼠龄在6—10周不等,取得四肢长骨中的骨髓细胞后,Histopaque-1083密度梯度离心法分层提取出骨髓中的单个核细胞(Mononuclear cells,MNC), Sca-1抗体染色MNC,将细胞用超级顺磁性的MACS MicroBeads (MACS微型磁珠)特异性地标记,置于一个强而稳定磁场中,分选出Sca-1+细胞,上流式细胞仪检验细胞分离纯度；3.2建立心肌梗死模型,结扎小鼠左冠状动脉,关胸后,不待小鼠清醒,立即球后注射200μl预先提取的骨髓源性Sca-1+细胞(2×106/200μl),注射后的24小时/48小时/72小时分别尾静脉取血涂片,并球后取血200μ1,流式细胞仪检测外源性Sca-1+细胞在体循环情况；3.3小动物在体拍照系统,Sca-1+细胞球后注射后示踪,分别于0h/22h/72h拍照,进一步观察细胞的去向。4、Sca-1+细胞的治疗对于心肌梗死后血管再生的作用。4.1观察心肌梗死小鼠经细胞治疗后的生存率,超声心动图观测各个实验组心脏左室舒张末径(LVEDD),左室收缩末径(LVESD),左室壁和室间隔厚度,计算左室射血分数(LVEF);4.2流式细胞仪检测建立模型后2周/4周/6周的PB/BM EPC比例；4.3第2周及第6周末取各实验组小鼠心脏,冰冻切片,IB4(内皮细胞)染色后计数毛细血管密度。结果：1、高同型半胱氨酸血症抑制小鼠心肌梗死后的血管再生。8-12周龄的高同型半胱氨酸(hCBS+Cbs-/-)小鼠射血分数低于对照组(hCBS+Cbs+/-)小鼠,具有统计学意义,并且其心脏毛细血管密度低于对照组小鼠。建立小鼠心肌梗死模型后,hCBS+bs-/-小鼠的生存率明显低于对照组,几乎很难存活,且存活的高同型半胱氨酸血症小鼠(hCBS+Cbs-/-+MI组)射血分数、心脏毛细血管密度均低于对照组,细胞凋亡率高于对照组。2、8-12周龄高同型半胱氨酸血症小鼠(hCBS+Cbs-/-)外周血(PB)源性内皮祖细胞比例低于对照组；骨髓(BM)源性内皮祖细胞比例高于对照组,但细胞死亡率高于对照组。同时比较hCB S+Cbs+/-+MI与hCBS+Cbs-/-+MI组,两组小鼠心肌梗死后2周及6周PB以及BM来源的EPC比例,高同型半胱氨酸组均低于对照组,且细胞死亡率均高于对照组。3、骨髓源性Sca-1+细胞治疗,对于小鼠心肌梗死后血管再生修复的作用。骨髓源性Sca-1+细胞纯化率可达85%左右,球后注射细胞24h后,GFP+细胞占外周血的1.75%,72h后,下降至0.65%；在体动物拍照示踪可见细胞球后注射6h后大多聚集于肝脏和胸腔,22h后大部分聚集在心腔。经过骨髓源性Sca-1+细胞静脉注射治疗,高同型半胱氨酸血症组(hCBS+Cbs-/-)小鼠以及对照组(hCBS+Cbs+/-)小鼠心肌梗死后生存率均得到提高,hCBS+Cbs-/-小鼠组6周生存率从12.5%上升到27.3%,hCBS+Cbs+/小鼠组从62.5%上升到80%,均具有统计学意义。hCBS+Cbs-/-小鼠组6周末左室射血分数(LVEF)由19.3%上升到38.5%,对照组由31.6%上升至50.9%,具有统计学意义；流式细胞仪检测MI+细胞治疗后2周/4周/6周的PB/BM EPC比例显示：对照组(hCBS+Cbs+/-)小鼠中,接受细胞治疗后外周血EPC比例显著增高,由单纯心肌梗死模型(2周末)的0.46%,上升到0.76%,hCBS+Cbs-/-小鼠组也从0.30%上升到0.39%,具有统计学意义；与此同时,两个实验组接受细胞治疗后,心脏毛细血管密度均有升高。结论：高同型半胱氨酸抑制了内皮祖细胞的分化与迁移,以致心肌梗死后的血管再生受到抑制,增加了高同型半胱氨酸血症小鼠的心肌梗死死亡率。