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第一部分联苯磷化氢氧化物-1对人T淋巴细胞上Kv1.3钾通道及IL-2分泌的阻断作用背景：联苯磷化氢氧化物-1(DPO-1)是新型Kv1.5钾通道阻断剂,它可选择性地延长心房有效不应期,有望用于心房颤动(房颤)的治疗。Kv1.3钾通道主要表达在T淋巴细胞,参与其激活、迁移、增殖及细胞因子分泌,且选择性阻断Kv1.3钾通道已成为免疫调节治疗的重要靶点。本文旨在研究DPO-1对人T淋巴细胞上Kv1.3钾通道及IL-2分泌的阻断作用。方法：分离培养人外周血淋巴细胞及Jurkat细胞,利用全细胞膜片钳技术记录T淋巴细胞上的Kv1.3及钙激活的钾(KCa)通道电流,实时定量PCR以及western blot方法检测Kv1.3通道的表达水平,荧光染料fluo-3检测胞内钙离子浓度,并用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测Jurkat细胞的IL-2分泌。结果：DPO-1以电压依赖和浓度依赖的模式阻断Kv1.3通道电流,在+40mV的电压下其阻断的IC50在Jurkat细胞中为2.58μmol/L,在外周血T淋巴细胞中为3.11μmol/L。同时,DPO-1加速了Kvl.3的失活速率,并使稳态失活曲线负向移动。无论在Jurkat细胞中,还是在外周血T淋巴细胞中,3μmol/L DPO-1对钙激活的钾(KCa)通道电流均无明显的抑制作用。在Jurkat细胞中,3、10μmol/L的DPO-1孵育24小时后,细胞上的Kv1.3钾通道电流密度下调,且蛋白表达水平分别减少48±6%、60±9%。此外,DPO-1孵育可抑制钙耗竭Jurkat细胞的钙离子内流,并减少激活的Jurkat细胞IL-2的分泌。结论：Kv1.5通道阻断剂DPO-1可阻断Kv1.3钾通道,减少Kvl.3通道的表达,抑制Jurkat细胞的钙离子内流及IL-2分泌。DPO-1具有免疫调节作用,可能有利于它在房颤治疗中的应用。第二部分Acacetin阻断人T淋巴细胞上Kv1.3钾通道并抑制T细胞的激活背景：Acacetin是从中草药雪莲花中提取的一种天然黄酮类化合物,它有希望成为新型的房颤治疗药物,并已被证实具有抗炎及免疫调节作用,但其抗炎机制仍需进一步阐明。本实验主要研究Acacetin对人T淋巴细胞上Kv1.3钾通道的阻断作用,同时观察在T淋巴细胞中Acacetin是否具有免疫调节作用。方法：分离培养外周血淋巴细胞及Jurkat细胞,采用全细胞膜片钳技术记录Kv1.3钾通道及钙激活的钾通道(KCa)电流；利用实时定量PCR及western blot检测Kvl.3钾通道的表达；用fluo-4AM钙荧光染料反映Jurkat细胞钙离子浓度变化,CCK-8试剂盒检测T淋巴细胞的增殖,并用ELISA方法观察IL-2的分泌水平。主要结果：Acacetin可阻断Kv1.3钾通道电流,并呈电压和浓度依赖性地负向移动稳态失活曲线。其在电流峰值及尾端阻断的IC50分别为21.09±2.75及3.63±0.25μmol/L。但是,30μmol/L的Acacetin对KCa通道电流无阻断作用。Acacetin的24小时孵育也显著下调了Kv1.3钾通道的表达水平。除此之外,在阻断Kv1.3钾通道电流的同时,Acacetin也显著阻断了T淋巴细胞的钙离子内流,并抑制了钙激活的转录因子NF-κBp65/p50及NFAT1的活性。并且,我们发现,Acacetin明显下调了T淋巴细胞的增殖及IL-2分泌。最后,用siRNA干扰的方法对Kv1.3通道的表达进行抑制后,发现Acacetin对IL-2分泌的抑制作用明显减弱。结论：Acacetin可通过阻断Kv1.3钾通道而发挥免疫调节作用,可能为其在房颤或其他T淋巴细胞相关的免疫性疾病的治疗带来益处。第三部分在人T淋巴细胞中洛伐他汀通过阻断Kv1.3钾通道发挥免疫调节作用背景：洛伐他汀是属他汀类药物,即羟甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂,可减少异甲羟戊酸代谢通路的中间物合成,发挥抗炎及免疫调节等作用。近年来,他汀类药物成为房颤的“上游治疗”研究热点,对T淋巴细胞介导的自身免疫性疾病也有治疗作用,但其免疫调节机制仍需进一步研究。Kv1.3钾通道在T淋巴细胞的激活、迁移、增殖及细胞因子分泌中起重要作用,且选择性阻断Kvl.3钾通道已成为免疫调节治疗的重要靶点。本实验主要研究洛伐他汀对人T淋巴细胞上Kv1.3钾通道的阻断作用,阐明其对T淋巴细胞的免疫调节作用可能的新机制。方法：在Jurkat细胞系中,采用全细胞膜片钳技术记录Kv1.3钾通道及KCa电流；利用实时定量PCR及western blot检测Kvl.3钾通道的表达；用fluo-4AM钙荧光染料反映Jurkat细胞钙离子浓度变化,CCK-8试剂盒检测T淋巴细胞的增殖,ELISA观察IL-2的分泌水平。主要结果：洛伐他汀可呈浓度及电压依赖性地阻断Kv1.3钾通道电流,其对Kvl.3峰电流及尾端稳态电流阻断的IC50分别为39.81±5.11μmol/L、6.92±0.95μmol/L。洛伐他汀可浓度依赖性地加速通道的失活,使稳态失活曲线负向移动,同时对激活曲线无明显影响。但是,30μmol/L的洛伐他汀对Kca通道电流无阻断作用。24小时洛伐他汀孵育不影响Kv1.3钾通道的mRNA及蛋白表达。洛伐他汀也可抑制T淋巴细胞的钙离子内流,细胞增殖及IL-2分泌。洛伐他汀对IL-2分泌的阻断作用被甲羟戊酸部分逆转。使用siRNA技术沉默Kvl.3钾通道表达后,洛伐他汀对IL-2分泌的阻断作用明显减弱。结论：在人T淋巴细胞中,洛伐他汀可通过阻断Kv1.3钾通道,在T淋巴细胞中发挥免疫调节作用,可能是其治疗房颤及其他T淋巴细胞相关免疫性疾病的新机制。