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内切木聚糖酶(β-1,4-内切木聚糖酶,Endoxylanase/Endo-β-xylanase,EC3.2.1.8)是木聚糖降解酶系中最关键、最重要的酶,它可将木聚糖分子从内部即β-1,4-糖苷键处将其切断。按照其催化反应的最适pH值,内切木聚糖酶可分为三种类型:酸性内切木聚糖酶(最适pH3.0～5.0)、中性内切木聚糖酶(最适pH6.0～8.0)和碱性内切木聚糖酶(最适pH8.0～10.0)。中性和碱性内切木聚糖酶与酸性内切葡聚糖酶相比,具有pH值适应范围广、热稳定性好、发酵周期短等优点,在造纸、食品和饲料等工业中具有非常良好的应用价值。本文从内蒙古碱湖淤泥中分离到优质内切木聚糖酶产生菌株Streptomyces sp.H33;同时,对其所产中性内切木聚糖酶进行分离纯化,并进行酶学性质研究;在此基础上,利用PCR法克隆得到Streptomyces sp.H33中性内切木聚糖酶基因,并在大肠杆菌中成功进行了表达。本论文的主要内容有:(1)从碱湖淤泥中筛选到一批产中性木聚糖酶菌株。其中,菌株H33产酶能力较强,液体发酵酶活达51.4U/mL,通过16S r DNA序列种属鉴定为链霉菌(Streptomyces)。与当前工业用酶菌株相比,Streptomyces sp.H33属于嗜碱的极端微生物,可在高碱性条件下(pH9.0)培养,具有可有效抑制杂菌污染,有利于大规模的发酵生产的优点。本论文重点对Streptomyces sp.H33进行研究。(2)利用阳离子交换层析分离到Streptomyces sp.H33产生的优质中性内切木聚糖酶蛋白,天然酶蛋白的实测分子量约为42kDa。酶学特性研究结果表明,该木聚糖酶反应的pH值以7.0左右为适,在中碱性条件下具有较高酶活和稳定性,反应温度以55℃左右为宜,该酶在pH10.0条件下温育处理60min和60℃条件下保温60min后酶活均能保持80%以上,且具有耐热、耐碱、耐多种金属离子等优良特性。可见,该酶与造纸工业的用酶要求能够合理衔接,具有非常良好的应用前景。(3)克隆到Streptomyces sp.H33新的中性内切木聚糖酶基因。通过Touch down PCR和TAIL-PCR技术从Streptomyces sp.H33的基因组DNA中克隆到酶基因完整开放阅读框(ORF)。该ORF长1380 bp,编码459个氨基酸,等电点(pI)为8.18,其中,前22个氨基酸为基因编码的信号肽序列,成熟酶蛋白从Leu23开始共计437个氨基酸。BLAST分析结果表明,其氨基酸序列与10家族的木聚糖酶endo-1,4-beta-xylanaseStreptomyces pristinaespiralis ATCC 25486同源性最高,但仅有78%的相似性。根据序列分析结果结合酶蛋白分子量、等电点及酶学特性等方面的差异判断,Streptomyces sp.H33中性内切木聚糖酶基因为一新发现的β-1,4-内切木聚糖酶基因。(4)实现了Streptomyces sp.H33中性内切木聚糖酶基因在大肠杆菌中的高效表达。用PCR方法从Streptomyces sp.H33的基因组DNA中扩增出酶基因全长,利用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切将其插入到原核表达载体pET-28a(+)中,得到重组质粒,并转化大肠杆菌E.coli BL21 Star(DE3),经过大量筛选可得到高效表达木聚糖酶的重组大肠杆菌菌株。重组大肠杆菌菌株表达的最高酶活可达62 U/mL。通过Ni-Sepharose 6 Fast Flow亲和层析分离得到重组酶蛋白XYN-H33,酶学特性研究发现,重组内切木聚糖酶XYN-H33与分离得到的天然酶蛋白的相应酶切特性基本一致,表明该中性内切木聚糖酶基因在大肠杆菌中已成功表达。