富血小板--白细胞凝胶/牡蛎复合型人工骨替代物的生物安全性评估

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目的:将牡蛎与富血小板—白细胞凝胶进行结合,并对该材料的生物安全性进行较为全面的评估,从而为下一步的有效性动物实验提供安全性基础。
  方法一:选取牡蛎并将其塑成长约15mm,直径约5mm的条状物。在一端转出两个直径约1mm的小孔,并将小孔转至另一端。之后用生理盐水冲洗3次并于自然条件下风干再将其置入乙醇中浸泡24h进行脱脂处理,取出后再次冲洗,冲洗完毕后置入双氧水中浸泡24h进行脱蛋白处理。于实验时将其投入高温高压灭菌锅中进行进一步灭菌处理。选取健康、成年的新西兰大耳兔10只,分为两批(每批5只)采用抗凝血管抽取血液约15ml,并在其中注入抗凝剂(柠檬酸钠0.3ml),之后使用离心机进行离心处理15min,转速为3200r/min。取上清既为富血小板血浆(PRP)。于展开实验前选取第一批兔子并抽取其耳缘静脉血,分瓶列装,检测血常规、肝功能、肾功能,所得的数据作为相对应兔子的血常规、肝功能、肾功能的正常参考值。将富血小板血浆约0.5ml与溶于10%的氯化钙溶液中的凝血酶冻干粉溶液约0.2ml同时注入牡蛎小孔处,使得富血小板血浆得以激活成富血小板—白细胞凝胶(PLG)并完成富血小板—白细胞凝胶/牡蛎复合型人工骨替代物的制作。选取上述两批兔子,于背部剃毛、消毒,在麻醉状态下选择背部正中切口并将自体富血小板—白细胞凝胶/牡蛎复合型人工骨替代物植入脊柱与肌肉之间的间隙。第一批兔子于术后1w、2w、3w、4w抽取耳缘静脉血检测其血常规、肝功能、肾功能的变化情况。第二批兔子于术后2w、4w、6w、8w、10w分批处死,并取得材料周围处的骨组织及肌肉组织,采取HE染色法将相应组织制作成病理切片,并观测是否存在炎性细胞及其它的相关炎性反应。
  方法二:选取牡蛎并将其塑成长约15mm,直径约5mm的条状物。在一端转出两个直径约1mm的小孔,并将小孔转至另一端。之后用生理盐水冲洗3次并于自然条件下风干再将其置入乙醇中浸泡24h进行脱脂处理,取出后再次冲洗,冲洗完毕后置入双氧水中浸泡24h进行脱蛋白处理。于实验时将其投入高温高压灭菌锅中之后再进行紫外线照射采取进一步灭菌处理。选取新生SD大鼠的乳鼠1只,于处死前抽取血液约3ml,并将其注入抗凝血管内(抗凝血管内含柠檬酸钠约0.3ml),之后使用离心机进行离心处理15min,转速为3200r/min。取上清既为富血小板血浆(PRP)。将富血小板血浆约0.5ml与溶于10%的氯化钙溶液中的凝血酶冻干粉溶液约0.2ml同时注入牡蛎小孔处,使得富血小板血浆得以激活成富血小板—白细胞凝胶(PLG)并完成富血小板—白细胞凝胶/牡蛎复合型人工骨替代物的制作,并使用该材料完成浸提液的制作。采用颈椎脱位法处死乳鼠,并取出颅骨。按原代成骨细胞的培养方式对细胞进行培养,培养至第1代。电镜下观测每一代细胞的生长情况,并于第1代时采用MTT法对细胞的毒性反应进行评估;
  结果一:使用SPSS17.0,将术后1w、2w、3w、4w抽取耳缘静脉血所得到的血常规、肝功能、肾功能数据与展开实验前的所得的正常值进行F检验(P>0.05),说明实验前后的血常规、肝功能、肾功能无明显变化。病理切片显示术后2w、4w、6w、8w、10w各个时间段的组织仅存在极少量的巨噬细胞、中性粒细胞且无其它明显的炎性反应,并出现了血管样增生改变。
  结果二:滴定材料浸提液的细胞组与正常细胞相比无形态学改变,细胞毒理分级为0-2级均在合格水平以上。
  结论:富血小板—白细胞凝胶/牡蛎复合型人工骨替代物具有较为良好的生物安全性。
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