捻转血矛线虫是寄生于反刍动物皱胃的一种常见多发的胃肠道线虫,给全球畜牧业造成了巨大的经济损失。目前,该线虫的防控仍然主要依赖于广谱的驱虫药,其中伊维菌素（Ivermectin,IVM）是最广泛使用的驱虫药之一,为该线虫的防控起了重大的作用。然而,IVM的长期使用而导致抗药性不断加剧,且其十分复杂的抗药机制还未明确。为此,本研究对捻转血矛线虫IVM抗药株和敏感虫株进行抗药性检测,在此基础上,采用转录组学和代谢组学比较IVM抗药株和敏感株之间的基因和代谢物的差异,筛选出抗药相关的基因和代谢物,从而预测潜在的抗药机制,为IVM抗药机制研究提供了理论依据和数据资源。此外,虽然苯并咪唑类抗药性机制最为透彻的,但是其抗药性在全球范围内最为严重。研究证明,在中国不同地理群中捻转血矛线虫与苯并咪唑类抗药性相关的β微管蛋白基因E198A突变频率比F200Y高。因此,本研究建立了一种快速检测β微管蛋白基因E198A位点的LAMP方法,为抗药性的实时监测提供技术支撑。本论文具体研究内容如下:1.捻转血矛线虫IVM抗药株抗药性检测首先通过三种线虫抗药性检测试验对所分离的疑似IVM抗药株和敏感株进行了抗药性检测。结果显示:在幼虫发育试验中,敏感株和抗药株的IC50分别为0.218ng/ml和1.291 ng/ml,抗药指数为5.9;在对照试验中,驱虫后第14天的成虫负荷量的减少率为32.5%;在粪便虫卵减少试验中,驱虫前后相比,驱虫组每克粪便虫卵数（EPG）没有显著减少,虫卵减少率为-55%。与对照组相比,试验组驱虫后第14天EPG也没有显著下降,虫卵减少率为1%。结合这三种抗药性检测结果,证实获得捻转血矛线虫新疆株是IVM抗药株。2.捻转血矛线虫IVM抗药株和敏感株转录组学比较分析通过构建捻转血矛线虫IVM抗药株和敏感株雌雄虫cDNA文库,共鉴定到17857个mRNA,441个miRNA,其中已知基因和miRNA分别为16336个和160个,新鉴定到的分别为1521个和281个。在抗药株雄虫中,338和30个mRNA和miRNA显著上调,205个和21显著下调;在抗药株雌虫中,104和4个mRNA和miRNA显著上调,254个和5显著下调。差异表达基因当中,鉴定出可能与IVM抗药性相关的候选差异基因,主要包括受体功能（Glu Cl Rs、ACh Rs、GPCRs）、药物转运（Pgp）和代谢酶（CYPs、SDR、UGTs和GSTs）相关的基因。此外,还发现一些具有潜在作用的基因,主要以参与脂质代谢及表皮形成的基因为主。在差异miRNA分析中,鉴定出可能与IVM抗药性有关的miRNA,即mi R-1、mi R-2、mi R-133及mi R-5912b。GO分析结果显示,雌雄虫差异基因具有相似的GO富集趋势,雌雄虫上调基因主要富集到膜固有成分、膜的组成部分、肽酶活性、氧化还原酶活性、分子传感器活性、转运活性、信号受体活性、脂质代谢、碳水化合物结合等;雌雄虫下调基因主要富集到细胞成分、结构分子活性、角质层结构成分、胶原三聚体、蛋白质水解、离子转运、配体-门控离子通道活性等;差异miRNA靶基因GO富集中,雄虫差异miRNA靶基因主要富集到磷代谢过程、细胞蛋白质代谢过程、细胞修饰氨基酸生物合成过程、细胞部分、神经元部分、离子结合、蛋白结合、嘌呤依赖NTP的解旋酶活性等。雌虫差异miRNA靶基因主要富集到细胞蛋白质代谢过程、小分子代谢过程、含磷化合物代谢过程、阴离子结合、ATP结合、嘌呤核苷酸结合等。KEGG结果显示,雌雄虫差异基因富集趋势具有一定的相似性,主要富集到溶酶体、自噬、细胞凋亡、鞘脂信号通路、尼古丁成瘾（Nicotine addiction）、NOD1样受体信号通路、糖基磷脂酰肌醇、ABC转运蛋白及细胞色素P450;雌雄虫差异miRNA靶基因通路分析显示,雌雄虫注释到的通路也具有一定的相似性,主要为m TOR信号通路、MAPK信号通路、c AMP信号通路、钙离子信号通路、赖氨酸降解、丙酮酸代谢、嘌呤代谢及TCA循环等。mRNA和miRNA靶基因功能分类分析结果显示,雌雄虫差异基因和miRNA靶基因主要参与代谢过程,其中主要以氨基酸代谢为主。最终,随机挑选差异表达的11个mRNA和6个miRNA,利用RT-PCR进行验证,发现RNA-seq与RT-PCR结果保持一致,证实了测序数据的可信性。3.捻转血矛线虫IVM抗药株和敏感株代谢组学比较分析捻转血矛线虫IVM抗药株和敏感株代谢组学分析结果显示,共鉴定到42类705种代谢物。抗药株和敏感株之间共筛选86个差异代谢物,其中上调17种,下调69种,主要包括氨基酸及其衍生物（28种）、有机酸及其衍生物（14种）、核苷酸及其衍生物（10种）、激素（5种）、肉碱类（5种）等。基于KEGG通路分析发现86个差异代谢物主要富集到嘌呤代谢、氨基酸的生物合成、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的代谢、半胱氨酸和蛋氨酸的代谢、色氨酸代谢及核黄素代谢。通过以上结果,初步推测氨基酸代谢和嘌呤代谢可能与IVM抗药性产生有较为密切的关系。4.捻转血矛线虫β微管蛋白基因E198A的LAMP检测方法的建立本研究建立了用于苯并咪唑类抗药性检测的LAMP方法。结果显示,优化的LAMP反应体系和条件可以实现最佳的检测效率,可准确的区分抗药基因型和敏感基因型,并且通过可视化反应可以判断实验结果。此外,对中国八个不同地区采集的179条捻转血矛线虫成虫样本进行检测,发现抗药基因型检出率为8.3%～87%之间,总检出率为37%。表明所建立的LAMP方法可以适用于该虫β微管蛋白基因E198A的检测,适合于田间样本的快速检测。综上所述,本研究通过高通量测序对捻转血矛线虫IVM抗药株和敏感株之间基因转录水平和代谢水平差异进行比较研究,分析了抗药株和敏感株在基因转录和代谢水平的变化。最终通过联合分析提出了新的推测,氨基酸和嘌呤代谢可能与IVM抗药性有关。本研究不仅提供有价值的分析数据,也为更好的理解IVM抗药机制奠定了基础。此外,建立了苯并咪唑类抗药性LAMP检测方法,为苯并咪唑类抗药性的实时监测提供技术支撑。