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目的:急性肺损伤（acute lung injury,ALI）是临床常见的急危重症,常常因失控的炎症反应,发展为急性呼吸窘迫综合征,其死亡率常常超过40%。不幸的是目前仍缺少有效的方法终止这种失控的炎症反应。革兰氏阴性杆菌感染和大手术或者创伤导致的肠道菌群移位造成肠道革兰氏阴性杆菌在肺部分泌的内毒素主要成分为脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）,导致的ALI是其发病的主要原因之一。如果找到终止LPS引发的失控的炎症反应能够有效阻止急性肺损伤进展为急性呼吸急窘迫综合征将是治疗急性肺损伤的有效方法。巨噬细胞在炎症反应调控作用处于核心地位,具有很强的可塑性和异质性,在不同的微环境和刺激因素下可以分化为促炎作用M1表型或者分化为具有抗炎作用的M2表型巨噬细胞。在LPS诱导的ALI中,LPS通过破坏肺泡上皮细胞导致肺泡-血管屏障破坏,大量炎症细胞因趋化作用被招募到肺泡腔内其中包括血液中活化的单核-巨噬细胞。在LPS的刺激下,巨噬细胞可分化为M1型巨噬细胞,继续发挥其促炎作用,分泌大量炎症因子进一步吸引并活化其他血液中中性粒细胞,巨噬细胞,并再次活化被招募来的巨噬细胞,使其向M1表型分化,造成使用的炎症反应。有效抑制巨噬细胞向M1转化或者促进M1型巨噬细胞向M2转化也许是有效LPS诱导急性肺损伤方法。LPS主要通过Toll样受体4（Toll-like receptor 4,TLR4）受体激活巨噬细胞,激活NK-κB通路促进大量炎症相关基因表达。其中NK-κB通路作为一种炎症基因的转录因子,70%的炎症基因主要通过含有Jumonji结构域的蛋白质3（Jumonji domain-containing protein 3,JMJD3）来调节表达的。JMJD3作为组蛋白H3赖氨酸残基27位点（Histone 3 lysine 27,H3K27）三甲基化（Trimethylation,me3）的特异性去甲基化酶,通过降低H3K27me3的甲基化水平促进基因表达,同时也影响组蛋白H3赖氨酸残基4位点（Histone 3 lysine 4,H3K4）的三甲基化水平。这种由H3K27和H3K4共同调控巨噬细胞的基因表达,而不会改变巨噬细胞的DNA序列,而改变基因表达的方法即表观遗传改变。但是,LPS诱导的巨噬细胞诱导的H3K27与H3K4参与,并导致巨噬细胞表观遗传改变,使其向M1表型转化,并抑制其向M2表型转化的机制尚不清楚。通过研究巨噬细胞因LPS刺激向M1表型转化的机制,并抑制该机制也许能够有效控制巨噬细胞向M1转化,进而有效治疗急性肺损伤。组蛋白H3K27与H3K4两个位点三甲基化水平调控着巨噬细胞的表观遗传,但是二者对于基因表达的作用却不同,H3K27三甲基化水平降低代基因表达的促进而H3K4三甲基化水平降低代表着基表达的抑制,二者共同调节着基因表达。两个位点调控巨噬细胞的表观遗传,但是二者之间在LPS刺激下的相互调控关系仍未被查明。JMJD3作为H3K27三甲基化特异性去甲基化酶,其介导的H3K27位点去甲基化是调控巨噬细胞的起始点,而H3K27如何将甲基化/去甲基化信号传递至H3K4,使H3K27与H3K4共同调节巨噬细胞的表观遗传的仍需要研究。因次,结合既往的染色质免疫沉淀测序数据和文献分析,CCAAT增强子结合蛋白β（CCAAT/enhancer binding proteinβ,C/EBPβ）和组蛋白赖氨酸去甲基化5A[lysine（K）demethylase 5A,KDM5A]两个基因可能参与了H3K27至H3K4的甲基化传递。其中,C/EBPβ是巨噬细胞重要的有关炎症的调节分子,调节着巨噬细胞的炎症反应,而巨噬细胞M1/M2的表型转化正是最重要的炎症反应调节机制。KDM5A是一种H3K4me3特异性去甲基化酶,在LPS刺激巨噬细胞中升高,且能够导致H3K4me3下游支配基因减少,因此本研究着重调查C/EBPβ与KDM5A在H3K27-H3K4甲基化信号传导,巨噬细胞表观调控间的作用。有文献报道称白介素4诱导蛋白1（Interleukin4 induce protein 1,IL4i1）IL4i1能够调节多种免疫细胞的表型激活与分化,并且具有抗炎作用,且有可能抑制巨噬细胞向M1转化,能够促进M1表型标志物精氨酸降解,并促进巨噬细胞分泌白介素10,这两种作用均有可能使巨噬细胞向M2方向转化。因此,给予以上的既往研究内容和调整巨噬细胞的抗炎或者促炎及可能对急性肺损伤的治疗作用,本研究应用LPS气管内滴入模型制作小鼠急性肺损伤模型,应用LPS刺激RAW264.7细胞进行体外研究以调查H3K27-H3K4甲基化传递机制以及IL4i1在LPS巨噬细胞表型转化中的关键做作用,力图找到一种新的治疗LPS诱导急性肺损伤分子靶点。研究方法:第一部分:JMJD3通过调节IL4i1诱导急性肺损伤中巨噬细胞表型变化。1.使用LPS气管内滴注诱导C57BL/6j小鼠急性肺损伤模型,使用GSK-J4抑制JMJD3治疗LPS诱导急性肺损伤;2.使用LPS刺激RAW264.7巨噬细胞,使用GSK-J4抑制细胞JMJD3表达;3.通过苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining,HE）观察LPS诱导急性肺损伤,抑制JMJD3对LPS诱导急性肺损伤的治疗作用;4.采用Elisa监测各组间小鼠肺泡灌洗液,外周血及细胞培养液上清IL1β,IL6和TNF-水平;5.利用免疫荧光监测各组间细胞和肺组织JMJD3,IL4i1,M1巨噬细胞标志物（i Nos）和M2巨噬细胞标志物（CD206）表达水平;6.利用Western Blot和RT-PCR技术监测巨噬细胞JMJ3和IL4i1表达水平及转录水平;7.利用慢病毒转染过表达LPS刺激的巨噬细胞IL4i1;8.应用Western Blot分析对照组,LPS刺激组,GSK+LPS组,LPS+IL4i1过表达组和GSK-J4+LPS+IL4i1过表达组i Nos和CD206表达水平;9.应用流式细胞学分析对照组,LPS刺激组,GSK+LPS组,LPS+IL4i1过表达组和GSK-J4+LPS+IL4i1过表达组M1/M2细胞表达比例。第二部分:JMJD3通过H3K27位点去甲基化升高C/EBPβ表达1.使用LPS气管内滴注诱导C57BL/6j小鼠急性肺损伤模型,使用GSK-J4抑制JMJD3治疗LPS诱导急性肺损伤;2.使用LPS刺激RAW264.7巨噬细胞,使用GSK-J4抑制细胞JMJD3表达;3.应用Western Blot和RT-PCR技术监测巨噬细胞H3K27me3和C/EBPβ表达水平及转录水平;4.利用Western blot,RT-PCR,免疫荧光监测各组间细胞和肺组织H3K27me3和C/EBPβ的表达;5.应用酶切发裂解蛋白染色质复合物,选取5:30min作为最佳裂解时间;6.利用ChIP-PCR分析H3K27me3与C/EBPβ的调控关系。第三部分:C/EBPβ通过促进Kdm5a转录进而通过降低H3K4三甲基化水平最终抑制IL4i1表达。1.使用LPS气管内滴注诱导C57BL/6j小鼠急性肺损伤模型,使用GSK-J4抑制JMJD3治疗LPS诱导急性肺损伤;2.使用LPS刺激RAW264.7巨噬细胞,使用GSK-J4抑制细胞JMJD3表达;3.利用Western blot,RT-PCR和免疫荧光监测KDM5A,H3K4me3和IL4i1的表达;4.利用ChIP-PCR分别对C/EBPβ-Kdm5a和H3K4me3-Il4i1在LPS刺激组和对照组的转录调控关系进行分析;5.利用细胞荧光分别验证KDM5A和H3K4me3,H3K4me3和IL4i1,H3K4me3和i Nos,H3K4me3和CD206间的调控关系;6.在LPS刺激组和正常对照组小鼠肺组织分别进行H3K27me3与IL4i1和H3K4me3与IL4i1进行组织免疫荧光双染。结果:第一部分:JMJD3通过调节IL4i1诱导急性肺损伤中巨噬细胞表型变化1.LPS可以导致小鼠肺组织实变炎症细胞聚集肺泡塌陷,抑制JMJD3可以改善LPS诱导的小鼠急性肺损伤病理变化;2.LPS可以增加小鼠肺泡灌洗液,外周血和LPS刺激细胞培养液IL1β,IL6和TNF-α水平,抑制JMJD3可以减轻炎症水平上升;3.LPS可以诱导小鼠肺组织JMJD3表达上升,IL4i1表达下降,M1巨噬细胞标志物i Nos表达上升,M2巨噬细胞标志物CD206表达下降;抑制JMJD3可以逆转IL4i1,i Nos和CD206表达;4.LPS刺激的RAW264.7细胞Western Blot,RT-PCR和细胞荧光JMJD3表达上升,IL4i1表达下降,M1巨噬细胞标志物i Nos表达上升,M2巨噬细胞标志物CD206表达下降;抑制JMJD3可以逆转IL4i1,i Nos和CD206表达;5.过表达IL4i1可以促使LPS刺激巨噬细胞向M2转化。第二部分:JMJD3通过H3K27位点去甲基化升高C/EBPβ表达1.小鼠肺组织免疫荧光提示LPS诱导H3K27me3表达降低,C/EBPβ表达上升,抑制JMJD3可以逆转以上表达趋势;2.LPS刺激的RAW264.7细胞Western Blot,RT-PCR和细胞与细胞荧光H3K27me3表达下降,C/EBPβ表达上升;抑制JMJD3可以逆转上述H3K27me3和C/EBPβ表达趋势;3.H3K27me3在C/ebpβ启动子区富集,LPS可以促进C/ebpβ转录;4.细胞免疫荧光发现JMJD3与H3K27me3,C/EBPβ与H3K27me3表达趋势相反。第三部分:C/EBPβ通过促进Kdm5a转录进而通过降低H3K4三甲基化水平最终抑制IL4i1表达1.Western blot,RT-PCR和组织免疫荧光提示LPS可促使KDM5A表达增高,H3K4me3表达减少,抑制JMJD3可逆转以上表达趋势;2.C/EBPβ在Kdm5a启动子区富集,LPS可以促进Kdm5a转录;3.H3K4me3在Il4i1启动子区富集,而LPS可以通过降低H3K4me3来抑制Il4i1表达;4.细胞免疫荧光发现KDM5A与H3K4me3表达趋势相反,IL4i1与H3K4me3表达同向;5.LPS在小鼠肺组织中可以抑制IL4i1与H3K27me3,IL4i1与H3K4me3表达,IL4i1与H3K27me3和H3K4me3表达同向。结论:第一部分:JMJD3通过调节IL4i1诱导急性肺损伤中巨噬细胞表型变化抑制JMJD3可以改善LPS诱导急性肺损伤的病理损伤和炎症水平;JMJD3可能通过下调IL4i1来促进巨噬细胞M1表型增多,M2表型减少促进炎症反应,加重LPS诱导炎症。第二部分:JMJD3通过H3K27位点去甲基化升高C/EBPβ表达1.JMJD3通过降低H3K27三甲基化水平促进下游基因表达;2.H3K27me3在C/ebpβ启动子区富集,LPS可通过提升JMJD3降低H3K27三甲基化水平促进C/ebpβ的表达。第三部分:C/EBPβ通过促进Kdm5a转录进而通过降低H3K4三甲基化水平最终抑制IL4i1表达C/EBPβ可以促进Kdm5a表达,LPS可以上调C/EBPβ表达促进Kdm5a表达;H3K4me3可以促进Il4i1表达,而LPS可以促使H3K4位点去甲基化,抑制Il4i1表达;巨噬细胞因H3K27与H3K4me3参与的甲基化传递改变其表观遗传,抑制/促进巨噬细胞向M1或者M2表型转化。