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白细胞介素2(Interleukin-2, IL-2)主要是由激活的T淋巴细胞产生的一类细胞因子,在机体免疫应答中起重要作用。其最重要的功能是诱导T淋巴细胞增殖(从G0期到S期)和分化,并且具有刺激T辅助细胞和自然杀伤细胞分泌细胞因子等功能。本研究以猪IL-2为研究对象,首次克隆出了淮南猪IL-2全基因,然后分别亚克隆到原核与真核表达载体中,并对其生物学活性进行了初步研究。主要内容包括:1.参照GenBank发表的猪IL-2 cDNA基因序列,设计1对引物,将淮南猪脾淋巴细胞在伴刀豆球蛋白A (ConA)的刺激下体外培养27 h后,提取激活淋巴细胞总RNA,进行反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增,然后克隆到pGEM-T Easy载体上并测序。测序结果显示,克隆的淮南猪IL-2 cDNA全长为516个碱基,开放阅读框(ORF)包含465个碱基,编码154个氨基酸,分子量为17.4 KDa,等电点为5.47,疏水氨基酸34%,亲水氨基酸34%,碱性氨基酸11%,酸性氨基酸23%。此cDNA与已报道的猪IL-2同源性为100%,与猫、牛、鸡、狗、鸭、山羊、马、人、家鼠等的IL-2基因进行比较分析,核苷酸同源性分别为83.7%,82.6%,28.2%,80.6 %,29.6%,83.4%,81.3%,82.0%,61.5%。2.为了在大肠杆菌中表达淮南猪IL-2基因,并鉴定其生物学活性,设计1对引物,将编码淮南猪IL-2的成熟蛋白基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,获得重组质粒pGEX-IL2,进而转化BL21感受态细胞中;经IPTG诱导后,通过SDS-PAGE检测淮南猪IL-2基因的表达情况,运用Western-blot和MTT法对表达蛋白进行特异性检测和活性测定。结果表明,淮南猪IL-2基因在大肠杆菌中得到高效表达,其表达蛋白具有特异性和生物学活性。3.为了在杆状病毒表达载体中表达猪IL-2基因,并鉴定其生物学活性,设计1对引物,将编码猪IL-2的成熟蛋白基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacDual中,获得重组质粒pFBD-IL2,进而转化含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac,发生转座作用;经抗性及蓝白斑筛选得到含猪IL-2基因的重组质粒rBacmid-IL2。然后将重组质粒转染昆虫细胞,间接免疫荧光表明猪IL-2在Sf-9昆虫细胞中获得了表达,SDS-PAGE可检测到分子质量为20 KDa的重组蛋白,Western blot证实该重组蛋白可与兔抗猪IL-2单克隆抗体发生特异性反应,表达产物经纯化后能明显促进猪T淋巴细胞转化。结果表明,猪IL-2基因在昆虫细胞中得到正确表达,其表达蛋白具有生物学活性。综上所述,本研究成功克隆出了河南优良地方品种淮南猪IL-2全基因,并分别在大肠杆菌表达系统和昆虫杆状病毒表达系统中进行了表达,对其表达产物进行了生物学活性测定,为进一步研究猪IL-2功能性蛋白作为分子佐剂在疫苗免疫中的促进作用及开发研制新型免疫增强剂定了基础。