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心肌梗死(MI),是心血管系统的常见多发疾病之一,严重威胁人类的生命与健康。虽然目前已有许多救治措施,使其急性期的死亡率明显下降,但是如何进一步提高急性MI后幸存者的长期生存率仍然是一大难题。目前经典的影响MI长期预后的因素主要包括:心室功能下降,长期复杂的室性心律失常,以及冠状动脉硬化的范围。动脉压力感受性反射(ABR),是心血管系统活动最重要的自身调节机制。其功能以动脉压力感受性反射敏感性(BRS)来表示,通常用去窦弓神经术(SAD)破坏其功能。近年来研究发现,ABR功能异常与多种心血管系统疾病的发病及预后相关,如慢性心衰,脑卒中,内毒素性休克,室性心律失常,动脉粥样硬化等等。1988年,意大利学者La Rovere及Schwartzs分别在病人及犬模型上发现了ABR功能可以影响MI的长期预后,即ABR功能较低的病人或犬,其MI急性期后的死亡率要远远高于ABR功能较高的病人或犬。但ABR功能影响MI预后的机制至今仍不清楚。有研究报导在体外尼古丁可以通过α7-nAChR促进肿瘤细胞的增值及内皮细胞的血管新生。然而α7-nAChR与ABR功能之间是否存在联系以及神经末梢分泌的乙酰胆碱是否在血管新生中发挥作用仍不清楚。酮色林是一个传统降压药物,对5-HT2A和α1受体都有较强的亲和力。我们实验室研究证实,小剂量的酮色林可以显著的改善自发性高血压大鼠(SHR)的ABR功能,而不影响其血压。因此酮色林可作为一个非常好的工具药,去证实单纯恢复ABR功能,能否促进MI术后的血管新生,并增强其心功能以改善其预后。本课题首先在大鼠上验证了在病人及犬上观察到的现象,并针对ABR功能影响MI预后的机制进行了深入探讨;我们提出了vagus-ACh-α7-nAChR这一全新的通路,以解释ABR功能影响MI预后的血管新生机制;并尝试用酮色林改善MI大鼠的ABR功能,通过促进MI后的血管新生以改善MI的预后,为改善MI的预后找到了可能的新的药物靶点。具体实验如下:实验一:验证ABR功能对MI大鼠生存时间的影响。Sprague-Dawley(SD)大鼠MI术后5周,清醒状态下测定其BRS,根据平均BRS(0.60 ms/mmHg)将52只大鼠分为两组,随后观察500天,记录每只大鼠生存期限。Kaplan–Meier生存曲线显示,BRS<0.60 ms/mmHg组大鼠的死亡率远远高于BRS>0.60 ms/mmHg组大鼠的死亡率,两组间的生存时间存在显著性差异;BRS>0.60 ms/mmHg组大鼠半数死亡的时间要远远长于BRS<0.60 ms/mmHg组大鼠;以生存时间250天为界,将大鼠分为两组,生存时间<250-day组的大鼠BRS显著低于生存时间>250-day组的大鼠;对两组大鼠的BRS和生存时间进行相关性分析,结果显示二者成显著的正相关,即BRS越高生存时间越长。以上结果说明ABR功能可以影响MI大鼠的生存时间,大鼠MI模型可以用来研究ABR功能影响MI预后的机制。实验二:SAD对大鼠血流动力学及心脏迷走神经活性的影响。SD大鼠行SAD或其假手术后2周,清醒状态下测定血压、心率及BRS,并静脉给予硫酸阿托品0.03 mg/kg使心率加快以检测迷走神经的张力,1周后造MI模型。用Western blotting检测MI术前和术后1周梗死边缘区膜蛋白中囊泡型乙酰胆碱转运体(VAChT)的表达情况。结果显示SAD大鼠血压和心率与假手术组相比无显著变化;SAD大鼠BRS(反映迷走神经反射性活性)显著低于假手术组;给予阿托品后,SAD组心率加快(反映迷走神经紧张性活性)的不是很明显,不及假手术组心率加快的一半;无论是否接受MI手术,SAD大鼠心肌VAChT的表达量都显著低于假手术组。这说明SAD大鼠心脏迷走神经活性要远低于假手术组的大鼠。实验三:研究ABR功能对MI大鼠血管新生的影响。SD大鼠行SAD或其假手术后2周造MI模型。MI术后2周用免疫组化法检测梗死边缘区的新生血管数;用ELISA检测MI术前,术后1、3、7、14天梗死边缘区总蛋白中VEGF的表达情况。免疫组化结果显示,SAD大鼠梗死边缘区新生血管的密度显著低于假手术组,约为后者的64.4%。ELISA结果显示,SAD大鼠梗死边缘区VEGF的表达显著低于假手术组(MI术后第1,3,7天)。由于两组间的差异在MI术后第3天最为显著,因此我们用western blotting检测了两组大鼠在MI术后第3天VEGF的表达情况,得到了与ELISA相类似的结果。这说明ABR功能低下可导致大鼠MI术后血管新生相对减少。实验四:α7-nAChR对MI术后血管新生的影响。如前所述,SAD大鼠MI术后1周,用Western blotting检测梗死边缘区膜蛋白中α7-nAChR的表达情况,结果显示SAD大鼠梗死边缘区α7-nAChR的表达显著低于假手术组。α7-nAChR基因敲除及其野生型小鼠MI造模2周后,用免疫组化法检测梗死边缘区的新生血管数。结果显示,α7-nAChR–/–小鼠梗死边缘区新生血管的密度显著低于野生型的小鼠。这说明α7-nAChR的表达可直接影响MI术后的血管新生,ABR功能通过影响α7-nAChR的功能及表达以影响MI术后的血管新生。实验五:氯化乙酰胆碱(ACh)对心脏微血管内皮细胞(CMECs)功能的影响。(1)对CMECs分泌VEGF的影响:ELISA结果显示,氯化ACh剂量依赖性的(1-1000 nM)促进VEGF的分泌。(2)对CMECs上VEGFR2磷酸化的影响:Western blotting结果显示,氯化ACh时间依赖性的(0-60 min)促进VEGFR2的磷酸化。(3)对CMECs迁移能力的影响:小管形成代表了CMECs的迁移能力。氯化ACh剂量依赖性的(1-1000 nM)促进CMECs的小管形成。用拮抗剂预处理时,与对照组相比,美加明和甲基牛扁碱显著抑制氯化ACh的上述作用,而阿托品则对其无影响。这说明氯化ACh是通过CMECs上的α7-nAChR促进VEGF的分泌、VEGFR2的磷酸化以及CMECs的迁移。实验六:氯化ACh促进CMECs血管新生的信号通路。Western blotting结果显示,氯化ACh时间依赖性的(0-60 min)促进Src、Akt和ERK1/2的磷酸化,并剂量依赖性的(1-100 nM)促进HIF-1α的表达。此外,ELISA结果显示,PP2、GF109203X、U0126、LY294002以及Rapamycin均可以显著的抑制氯化ACh促VEGF分泌的作用。这说明信号分子Src、Akt、ERK1/2、HIF-1α、PKC、MEK、PI3K、mTOR等都参与了氯化ACh促进CMECs血管新生的过程。实验七:酮色林对SHR MI术后血管新生及心功能的影响。给予SHR酮色林0.3 mg/kg/d以改善其ABR功能,2周后清醒状态下测定其血压、心率及BRS,并继续给予酮色林饲喂,其后的实验安排与检测指标同上述SAD大鼠类似,对照组给予标准饲料;此外,MI造模3个月后用超声心动图来检测心脏的射血分数,以代表大鼠的心功能,EF≤45%的大鼠,视为MI造模成功。结果显示:(1)对血流动力学及心脏迷走神经活性的影响:SHR给予小剂量酮色林后,其血压及心率与对照组相比无显著变化。酮色林组大鼠的BRS显著高于对照组;给予阿托品后,酮色林组大鼠的心率的加快也显著高于对照组。无论是否接受MI手术,酮色林组大鼠心肌VAChT的表达量都显著高于对照组。这说明酮色林可以显著的提高SHR心脏迷走神经的活性。(2)对MI术后血管新生的影响:免疫组化结果显示,MI术后2周,酮色林组大鼠梗死边缘区新生血管的密度显著高于对照组。ELISA及western blotting结果显示,MI术后第3天梗死边缘区VEGF的表达,酮色林组显著高于对照组。(3)对MI术后α7-nAChR的表达以及心功能的影响:MI术后1周,酮色林组大鼠梗死边缘区α7-nAChR的表达显著高于对照组。MI术后3个月,酮色林组大鼠心脏的射血分数显著高于对照组大鼠。这说明酮色林可以通过改善ABR功能来增强SHR MI术后的血管新生,从而提高其心功能。结论:本研究证明了ABR功能可以通过影响MI术后的血管新生来影响MI大鼠的预后;ABR功能通过vagus-ACh-α7-nAChR这一通路来影响MI大鼠的血管新生;酮色林可以通过改善ABR功能以促进SHR MI术后的血管新生,从而改善其预后;为将改善ABR功能以促进血管新生作为治疗MI的一条新策略提供了理论依据。