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目的本课题主要探讨人巨细胞病毒对人脐血红系爆式集落形成单位(BFU-E)及红系集落形成单位(CFU-E)形成的影响及作用机制,并用黄芪注射液、更昔洛韦作用于HCMV感染的CFU-E、BFU-E,探讨抗HCMV药物对HCMV感染所致CFU-E、BFU-E体外增殖抑制的影响。
方法1.20例脐血标本由本院产房提供,取自正常足月顺产新生儿断脐后的胎盘段脐血。
2.采用造血祖细胞体外培养技术,以HCMV持续感染人脐血红系祖细胞,观察计数HCMV感染后CFU-E、BFU-E集落产率、峰期及维持时间。
3.用PCR技术检测红系祖细胞内HCMV-DNA。
4.将黄芪注射液和更昔洛韦作用于HCMV感染后的红系祖细胞,分别计数其集落产率、峰期及维持时间。
5.实验分组:实验分8组:①空白对照组:不加病毒液,代之等量IMDM。②灭活病毒组(Ⅳ,灭活对照组):加入同体积灭活病毒液,排除病毒液中杂质的影响。③1:1000感染组:加入1:1000病毒稀释液0.1ml。④1:100感染组:加入1:100病毒稀释液0.1ml。⑤1:10感染组(病毒组):加入1:10病毒稀释液0.1ml。⑥黄芪组:在1:10感染组中加入黄芪注射液,终浓度为100ug/ml。⑦更昔洛韦组:在1:10感染组中加入更昔洛韦,终浓度为10ug/ml。⑧黄芪+更昔洛韦组:在1:10感染组中加入黄芪注射液和更昔洛韦,终浓度同上。
6.采用原位联苯胺染色法鉴定红系祖细胞。
7.统计方法:结果用均数加减标准差表(X±S)及抑制率、增殖率表示,进行方差分析,有统计学意义后组间均数两两比较用SNK法,由统计软件SPSS10.0完成。
结果1.HCMV对红系祖细胞体外增殖的影响。(1)与空白对照组比较,各浓度病毒组集落产率均减少。空白对照组集落产率CFU-E814.40±211.79/2×105BMNC(单位下同)、BFU-E37.20±3.98分别与灭活病毒组CFU-E799.30±209.57、BFU-E36.60±4.58和1:1000感染组CFU-E744.40±180.16、BFU-E33.60±4.39比较,无统计学意义(P>0.05);而1:10感染组CFU-E392.25±119.25、BFU-E17.10±3.58和1:100感染组CFU-E588.30±152.73、BFU-E23.40±5.11分别与空白对照组、灭活病毒组比较有统计学意义(P<0.01),其抑制率分别为CFU-E:30.15%、50.84%;BFU-E:36.07%、53.28%。表明HCMV感染后红系祖细胞集落产率随病毒浓度的增高而减少,抑制率随病毒浓度的增高而增大。提示HCMV对红系祖细胞集落形成有明显抑制作用。
(2)CFU-E集落维持时间,1:10感染组集落约8天,空白对照组、灭活病毒组CFU-E约11天,1:100感染组、1:1000感染组约9天;BFU-E集落维持时间,1:10感染组约19天,空白对照组、灭活病毒组约24天,1:100感染组约21天,1:1000感染组约23天;CFU-E第5-7天达高峰,BFU-E第10-18天达高峰,各组无差异。表明HCMV感染后红系祖细胞集落维持的时间缩短,但集落出现峰值的时间无明显差异。
2.用PCR检测发现HCMV感染组红系祖细胞集落细胞中存在HCMV-DNA而空白对照组和灭活病毒组则不存在。表明HCMV可直接感染红系祖细胞。
3.黄芪和更昔洛韦对HCMV感染所致的CFU-E、BFU-E体外增殖抑制的影响。
(1)黄芪组(集落产率CFU-E为520.10±146.54、BFU-E为25.60±3.20)和更昔洛韦组(CFU-E为514.35±145.82、BFU-E为24.60±3.90),两组的集落产率均明显高于病毒组(CFU-E为388.35±116.38、BFU-E为19.15±2.64)有统计学意义(P<0.01),其增殖率分别为CFU-E:32.59%、31.13%;BFU-E:49.71%、43.86%。而黄芪组与更昔洛韦组两者之间则无显著差异(P>0.05)。黄芪+更昔洛韦组(CFU-E为681.90±191.25、BFU-E为28.21±7.66)集落产率分别与黄芪组与和更昔洛韦组比较有统计学意义(P<0.01),其增殖率为CFU-E:73.84%、BFU-E:64.97%。表明在HCMV感染组中加入适量的黄芪和更昔洛韦后,能明显提高CFU-E、BFU-E集落的产率,提示黄芪和更昔洛韦能有效地抑制HCMV所致的CFU-E、BFU-E增殖抑制的发生,两者联用能增加这种作用。
(2)CFU-E集落维持时间,病毒组(1:10)约8天,空白对照组约11天,药物组维持时间约10天;BFU-E集落维持时间,病毒组约19天,空白对照组约24天,黄芪组、更昔洛韦组约21天,黄芪+更昔洛韦约23天。集落高峰期各组无差异。表明黄芪和更昔洛韦能延长HCMV感染后CFU-E和BFU-E集落的维持时间,但集落出现峰期的时间无差异。
结论1.红系祖细胞是HCMV-AD169的宿主细胞之一,在体外HCMV-AD169对红系祖细胞生长,集落形成有明显抑制作用。
2.HCMV感染患儿出现贫血,可能与HCMV直接感染红系祖细胞,并使之损伤有关。
3.在体外黄芪和更昔洛韦均有抗HCMV的活性,能有效地抑制HCMV感染所致的红系祖细胞增殖抑制的发生,两者联用能增加这种作用。