研究背景:中药化香,为胡桃科(Juglandaceae)化香树属(Platycarya S.)多种植物药材的统称。化香树果序,为化香树的果序,别名化香树球,广泛分布于陕西、甘肃、河南及长江以南各省。化香树果序的性味为辛、温,具有清热解毒、活血化瘀、清肿排脓、通窍止痛的功效,民间用于治疗鼻窦炎、鼻咽癌。化香树果序中含有食子酸、鞣花酸、槲皮素、3,3-二甲氧基鞣花酸等成分,这些成分均具有抑制肿瘤细胞增殖的作用。鼻咽癌是源自于人鼻咽部上皮组织的恶性肿瘤,是我国最常见的头颈部恶性肿瘤之一。世界卫生组织调查报道,全球有80%的鼻咽癌患者在中国,华南地区是全世界鼻咽癌发病率最高的地区,发病率为30/10万～50/10万。临床治疗主要以放疗、化疗为主,但复发率较高、5年生存率较低。随着中医药现代研究的蓬勃发展,中药有效部位或成分应用于肿瘤治疗发挥了重要作用,加强对鼻咽癌确有疗效中药资源开发、有效部位作用机制研究一直是鼻咽癌防治研究的重点之一。细胞死亡是生命活动过程中一项重要的生理或病理现象。常见的细胞死亡方式主要包括凋亡、坏死和自噬等。新近研究发现了一种新的细胞死亡方式-Methuosis,在这种细胞死亡过程中,由于过度刺激导致细胞内水泡产生、积累、融合而逐步形成大量巨大液泡,最终导致细胞代谢活动减少、细胞膜破裂直至细胞发生Methuosis死亡。Methuosis是一种新的蛋白酶独立细胞死亡形式,过度活化RAS和RAC可诱发这种形式的细胞死亡。在细胞死亡过程中,溶酶体不能与巨胞饮小体融合,反而空泡不断积累融合而逐步形成较大的液泡,最终导致代谢活动减少、细胞膜破裂。Methuosis区别于凋亡、类凋亡、自噬、胀亡等已发现的细胞死亡方式,为细胞死亡的途径研究增添了新的内容,为恶性肿瘤的发生、发展、治疗等研究提供新的方向,成为肿瘤研究的热点之一。部分中草药具有抗肿瘤作用已经得到确认,目前报道的抗肿瘤作用机制主要集中在中药有效部位诱导肿瘤细胞凋亡、抑制细胞增殖、诱导肿瘤细胞分化和调节细胞信号内转导等方面。检阅国内外文献,国内文献主要集中在化香树提取物的细胞毒性、抗菌、抗氧化和抗衰老作用,化香树果序作为复方中药成分治疗急慢性鼻炎、鼻窦炎,国外文献对化香树果序中的部分单体成分的抗肿瘤作用进行了研究,但未见化香树果序总醇提物抗癌作用的相关文献报道。本课题是在检阅《本草纲目》、《中华本草》、《中药大辞典》等文献,参考民间用药基础、结合文献研究及课题组前期研究基础,通过体内外实验研究化香树果序醇取物诱导鼻咽癌细胞发生Methuosis死亡发挥抗鼻咽癌的作用,并对其作用机制进行初步研究。目的:研究化香树果序醇提物的抗肿瘤活性,探讨化香树果序醇提物的抗肿瘤机制。并且通过建立裸鼠鼻咽癌移植瘤模型,进一步研究化香树果序醇提物体内的抗肿瘤活性。方法:第1部分化香树果序有效部位的提取鉴定根据化香树果序的有效成分的溶解性质,借鉴西北大学高蓉博士化香树果序活性成分提取、分离、纯化等研究方案,取生药材化香树果序4.5kg,60%乙醇回流方法提取,旋转蒸发仪浓缩干燥,HPLC、GC-MS分析主要成分。第2部分化香树果序醇提物致鼻咽癌细胞发生Methuosis死亡2.1倒置显微镜和透射电镜观察CNE1/CNE2形态变化CNE1/CNE2 细胞接种于 6 孔培养板(1.2×105cells/ml,2ml/孔),37℃,5%CO2培养箱中培养24h后分组进行药物处理,观察培养4h、8h、12h、24h、48h后各组细胞的形态变化。待药物处理细胞24h后,离心收集约5×106细胞,用PBS洗涤两次后,弃上清,加1ml 2.5%戊二醛悬浮细胞,移入1.5ml Ep管中,经固定、染色后日立H-7650透射电子显微镜观察并拍照。2.2荧光显微镜观察细胞溶酶体、细胞核的变化取对数生长期人鼻咽癌CNE1、CNE2细胞爬片接种于6孔培养板(1.2-1.5×105个/ml,2ml/孔),培养24h后分组处理:对照组加入培养液;处理组加入1.0mg/ml化香树果序醇提物,25μM槲皮素,2ml/孔,继续培养24h后,添加37℃预热的溶酶体探针染液,浓度为1μM,PI浓度为5μg/ml,避光孵育0.5h,在倒置显微镜下观察各组细胞的形态变化并拍照。2.3 MTT法测定化香树果序醇提物对CNE1/CNE2增殖抑制率CNE1/CNE2细胞各分为对照组、实验组。实验组设置0.25mg/ml、0.50mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml 四个浓度组,细胞处理 24h、48h 后,依照 MTT试验流程加入MTT、DMSO,酶标仪在490nm波长测定吸光值(OD值)。2.4流式细胞仪检测细胞凋亡情况CNE1细胞、CNE2细胞与1.0mg/ml的化香树果序醇提物共同孵育24h后停止培养,用不含EDTA的胰蛋白酶消化细胞,离心后细胞用PBS洗2次,再用FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit 中的 1X 缓冲液 100μL 重悬细胞,加入FITC和PI各5μL,避光,室温放置15min。每管细胞中再分别加入400μL的IX缓冲液,充分混匀后于1h内上样,用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。2.5流式细胞仪检测细胞周期分布CNE1和CNE2细胞分别与1.0mg/ml的化香树果序醇提物,共同孵育24 h后收集细胞,细胞用PBS洗2次,再用预冷的体积分数为75%乙醇混悬细胞,置于4℃冰箱密封保存过夜。离心收集细胞,PBS洗1次,每管细胞加入5000μL含PI(50μg/mL)及RNA酶(10μg/mL)的PBS溶液,细胞置于37℃避光孵育30min,后于1 h内上样,用流式细胞仪检测细胞周期的分布情况。第3部分化香树果序醇提物致鼻咽癌细胞发生Methuosis死亡的机制研究3.1高通量RNA测序分析基因表达和转录组差异CNE1/CNE2对照组、化香树果序醇提物(1.0mg/ml,24h)处理组样品提取总RNA,用Illumina HiSeq2500进行PE100双端测序。测序结果进行GO、KEGG分析,确定Methuosis靶基因、探讨信号通路。3.2荧光实时定量PCR(Real-time qPCR)检测相关基因表达提取各组细胞的RNA,进行逆转录DNA扩增仪进行扩增,Real-time qPCR相对定量法来比较RAS/RAF/MAPK1/MAPK3/SRF/FOS等基因表达差异:以空白组为对照,GAPDH为内参,计算△Ct值。3.3 Western Blot检测RAS/MAPK/FOS等相关蛋白表达差异化香树果序醇提物(1.0mg/ml)、槲皮素(25μM)处理细胞24h后,裂解细胞,蛋白定量,Westerm Blotting 检测相关蛋白 AKT、p-AKT、ERK、P-ERK、EGFR、RAS、RAF、FOS等表达情况第4部分化香树果序醇提物对荷瘤裸鼠的干预作用取对数生长期CNE1/CNE2CNE2,以3×106/0.2nml cells分别接种于体重为15.3～21.3g的雄性裸鼠右背部皮下。成瘤后按体重随机分成对照组、低浓度实验组和高浓度实验组,每组10只,实验组用化香树果序醇提物灌胃,剂量分别为4.0g/kg/d、8.0g/kg/d,灌胃体积为0.4ml/只,一日两次,连续给药10-20天;对照组用0.4ml/只生理盐水,连续灌胃10-20天,观察记录各组裸鼠生长及成瘤情况。统计学分析数据分析和作图均是由GraphPad Prism 5.0(数据分析和作图软件)提供,数据结果以x±s表示;多组间均数比较采用Oneway-ANOVA方法,各组分别与对照组比较采用Dunnett检验以及各组间比较采用Tukey检验。结果:1.取生药材化香树果序4.5kg,得化香树果序乙醇总提取物180g,出膏率为4.0%,水蒸气蒸馏法提取挥发油,提取率为0.12%,GC-MS分析结果表明化香挥发油的主要化合物是萜类化合物。通过高效液相色谱技术对化香树果序醇提物进行分析,结果发现化香树果序醇提物中的主要成分为酚酸或黄酮类成分,已鉴定主要化合物有没食子酸、槲皮素、鞣花酸、3,3-二甲氧基鞣花酸。2.MTT结果显示化香树果序醇提物对鼻咽癌肿瘤细胞具有时间、浓度依赖性的抑制作用,且其对于细胞的半数抑制率IC50值基本上在1.0mg/ml左右。这表明化香树果序醇提物对鼻咽癌肿瘤细胞具有较强的细胞毒性作用。3.化香树果序醇提物作用CNE1/CNE2株CNE1/CNE2 24h后,可见随着药物作用时间的延长,细胞膜相互融合,细胞质可见大量空泡,空泡相互融合,不断增大,最后细胞膜破裂,细胞核没有发生明显的变化。采用不同药物处理细胞,化香树果序醇提物浓度1.0mg/ml,槲皮素浓度为25.0μM,处理24h后,溶酶体荧光探针染色后,对照组细胞溶酶体数量正常,化香树果序醇提物组细胞溶酶体荧光明显减弱;PI染核后,化香树果序醇提物组细胞核没有明显变化,槲皮素组细胞核碎裂,染色质浓缩。4.流式测细胞凋亡的结果显示,与对照组相比较,经化香树醇提物处理的肿瘤细胞,其凋亡率没有明显增加,通过流式细胞仪对细胞周期分布的检测表明,经化香树果序醇提物处理的细胞,其G2/M期所占比率呈浓度依耐性的增多。即化香树果序醇提物能够促使肿瘤细胞阻滞在G2/M期,与紫杉醇阻滞肿瘤细胞生长周期类似。5.测序结果显示药物干预后CNE1细胞中RAS基因表达量降低,并发现DUSP5、MAPK1、MAPK3、SRF、FOS、FOSB等基因表达具有显著性差异。并且都为MAPK信号通路上的基因,与KEGG Pathway生物通路分析结果相吻合。6.根据高通量RNA测序结果分析,筛选出DUSP5、MAP1、MAPK3、SRF、FOS、FOSB等差异基因,进行了 qPCR验证,结果显示CNE1细胞经化香树果序醇提物处理后,DUSP5、FOS、FOSB基因表达量上升,RAS、MAPK1、MAPK3、SRF基因表达量下降。7.western结果表明经化香树果序醇提物处理组BECLIN1、P-AKT、PTEN蛋白均没有发生明显的变化,MAPK1/MAPK3蛋白表达量明显增加,这与前期的测序结果吻合。RAS、FOS蛋白表达降低,槲皮素处理组与对照组相比,EGFR、RAF、RAS、FOS蛋白表达量均降低。8.在整个实验过程中,对照组与实验组裸鼠的体重均增加,其差异无统计学意义(P>0.05)。8.0g/kg浓度药物组的平均瘤重,瘤体积与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05),抑瘤率为59.57%。结果显示化香树果序醇提物在体内对鼻咽癌细胞的生长具有抑制作用,且以8.0g/kg药物组抑制肿瘤生长的效果最明显。结论:一.采用醇回流法提取得到的化香树果序有效成分主要为黄酮和酚酸类,其出膏率约为4.0%,主要成分为酚酸或黄酮类成分,已鉴定主要化合物有没食子酸、槲皮素、鞣花酸、3,3-二甲氧基鞣花酸;二.化香树果序醇提物可诱导人鼻咽癌CNE1、CNE2细胞发生Methuosis死亡,从而抑制肿瘤细胞的,增殖,其程度与药物作用的时间和药物浓度呈正相关;三.化香树果序醇提物在体内也具有抗肿瘤活性,对人鼻咽癌裸鼠皮下移植瘤的生长具有抑制作用,其中以高浓度药物组(8.0g/kg组)的疗效较好;四.化香树果序醇提物诱导人鼻咽癌CNE1、CNE2细胞发生Methuosis死亡的机制与阻断RAS/MAPK/FOS信号转导通路有关。