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ThglL(tRNAHisguanylyltransferase1Like),也称为ICF45(InterphaseCytoplasmicFoci-45),是本实验室利用自身免疫病人血清通过筛选HeLa细胞的cDNA表达文库发现的一个新的胞质蛋白。间接免疫荧光分析显示ThglL间期在胞质中靠近核膜的位置形成1-2个点,其大小和形状与中心体相似,有时两者共定位(4.8±0.4%)。ThglL被沉默后,细胞增殖受到明显抑制,细胞周期进程被破坏,产生大量多核细胞。在ThglL被沉默后的细胞株中,中心体过度复制,细胞周期相关因子p53表达明显上升。本论文工作主要是尝试对ThglL的细胞内功能做初步的探究。
为研究ThglL细胞内定位的细节,用ThglL不同截短片段转染HeLa细胞,结果显示大部分的截短片段仍然在细胞质中呈典型的点状分布,而仅含有ThglL中部序列(122-179)的片段在细胞质中呈弥散分布,或者检测不到其表达(175-245)。这提示我们,在ThglL形成其特殊亚细胞定位中起主要作用的是其N端和C端。同时发现在转染ThglL全长或某些片段的细胞中,中心体的免疫荧光染色明显减弱甚至消失,表明ThglL或其片段的过表达影响了一些中心体蛋白例如γ-tubulin或一些自身免疫抗原在中心体上的聚集,这进一步显示了ThglL与中心体之间的密切关系。将ThglL上几个预测的可能的磷酸化位点突变后观察其亚细胞内定位的变化,其中Thr239突变后ThglL定位在细胞核内,表明ThglL的Thr239对其在细胞内的正确定位有重要作用。
应用基于逆转录病毒载体的RNAi系统沉默ThglL后,流式细胞光度术分析结果显示,细胞周期中G1期所占比例升高,S期比例减少,细胞增殖受阻生长缓慢。经westernblotting检测发现,p27的表达量明显增强,cyclinD1、cyclinE的表达量略微下降,c-myc表达水平明显下降。推测干扰ThglL的表达抑制细胞的增殖,可能是通过诱导p27的高表达,抑制CDK-cyclin复合体的活性,从而抑制了细胞向S期推进。
利用蛋白质组学的方法鉴定出ThglL被有效沉默的细胞株中的10个差异表达蛋白,其中上调蛋白6个,下调蛋白4个,其中上调蛋白包括真核翻译起始因子3(Eukaryotictranslationinitiationfactor3.subunit2beta),核因子-Y框结合蛋白1(Nucleasesensitiveelementbindingprotein1),热休克蛋白70(Heatshock70kDaprotein9Bprecursor),Transgelin2等。发生下调的蛋白包括A+U结合因子1(P37AUF1)已知与恶性肿瘤的发生有关。利用GSTPull-Down证明ThglL可以自身相互作用,鉴定出ThglL的两个潜在的相互作用蛋白rpl17、rps18,均为核糖体亚基的结构蛋白。结合ThglL的酵母中同源蛋白Thglp的tRNAHis修饰功能,推测ThglL在蛋白质合成过程中有重要作用。