呼吸系统疾病是家禽养殖业的疑难杂症,以传染率高、死亡率高和病因复杂而昭著,是影响和制约家禽健康生长的重要因素。临床上造成家禽呼吸道疾病的病原有很多,比如细菌、支原体、病毒以及免疫抑制性的病原等,其中鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum,MG）和大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）感染率普遍较高。这种混合感染比单一病原感染更为多见,因此临床治疗时常出现误诊误治的情况,这也加重了抗生素的滥用危害。在养殖业减抗限抗的大环境下,中药复方因其整体性、多成分和多靶点的特点展现出了极大的发展潜力。通过系统生物学和多向药理学的研究方法对中药和复杂疾病进行网络分析,能够在分子水平上更好的理解细胞以及器官的行为,加速中药有效成分靶点的确认以及新生物标志物的发现。因此,“多成分-多靶点-复杂疾病”的模式能更加顺应时代需求。本研究采用网络药理学方法筛选抗MG与E.coli混合感染的中药复方,并对其药效作用物质基础、中药复方配比、靶向治疗作用、提取工艺及颗粒剂制备进行系统性研究,旨在为兽医临床治疗呼吸系统疾病的药物开发奠定理论基础。（1）MG与E.coli感染模型的转录组学和代谢组学测序分析本研究结合实验室前期的研究基础,构建了MG与E.coli混合感染的动物模型,应用转录组学与代谢组学联合分析的方法,分别筛选两种病原体混合感染的关键靶点和差异代谢物。转录组学结果显示,MG与E.coli混合感染组共发现3115个差异表达基因,其中1456个基因上调,1659个基因下调。这些差异表达基因在KEGG数据库中广泛分布在6大类44个亚类中,对各亚类中的差异表达基因进行蛋白互作分析,汇总得到54个关键靶点基因,用于后续中药筛选。使用混合感染模型构建成功的血清样本进行非靶向代谢组学的研究,采用UPLC-QTOF/MS的正负离子模式下收集血清中的代谢物。结合fold change和q-value的单因素分析筛选差异表达代谢物共928个,用于后续组学联合分析。共有53个潜在的生物标记物被筛选出来,包括白三烯C4、白三烯D4、亚油酸和大量的能量代谢相关产物。（2）基于网络药理学的靶点网络构建与中药的反向筛选收集TCMSP中药数据库整库数据并构建中药网络,将上述筛选的54个关键靶点基因代入DRUGBANK数据库进行信息转换,得到25个药物作用的有效靶点,将这些药物靶点代入到TCMSP中药总网络反向筛选得到节点关联度前20位的中药,结合中药配伍规律筛选得到六味新中药复方（New Chinese Medicinal Compound,NCMC）,分别是君药:板蓝根、连翘;臣药:银杏叶、桑白皮;佐使药:甘草、丹参。从中药网络中筛选出这六味中药后,构建了该复方的“靶点-成分-中药”总网络。（3）均匀试验设计优化NCMC配比研究利用均匀试验和多指标评价的方法对上述获得的六味中药进行配比研究,多元回归分析确定各中药比例。在本研究中,6因素分别为板蓝根（X1）,连翘（X2）,银杏叶（X3）,桑白皮（X4）,甘草（X5）和丹参（X6）。综合评价分数作为因变量,由Y表示。多元二次方程由DPS数据处理系统建立:Y=-223.2+57.8×X2+0.5×X4+46.4×X5+0.1×X12-2.9×X22-2.0×X52+0.002×X2×X3-4.1×X2×X5,R2=0.999998,F值=62499.9063,回归显著性检验（P=0.0031）。结果表明,板蓝根:连翘:银杏叶:桑白皮:甘草:丹参的比例为14:7:11:12:5:3时具有最佳的治疗效果。（4）NCMC水提物对MG与E.coli混合感染的靶向治疗作用分析将NCMC制备成水提物,进行MG与E.coli混合感染的治疗试验。光学显微镜观察结果显示,混合感染组气管纤毛脱落,黏膜上层有杯状细胞增生,而NCMC水提物治疗组气管纤毛排列良好,但仍有少量炎症细胞浸润;扫描电镜（SEM）观察结果显示,混合感染经过NCMC水提物治疗后,纤毛明显丰富和完整;通过透射电镜观察,可见混合感染组气管纤毛破裂、倒置、细胞质肿胀,细胞外形成伞状突起。NCMC治疗组虽然有部分纤毛脱落,但与混合感染组相比症状明显改善。利用多组学联合分析网络获得混合感染关键靶点和代谢物,对NCMC水提物进行靶向验证。RT-PCR结果表明,除CHRM4、MMP2、VEGFA外,混合感染组分泌的趋化因子和黏蛋白等均有不同程度的爆发。而经过NCMC治疗后的靶点基因表现出了显著下调（P<0.05）;蛋白水平上,与混合感染组相比,NCMC治疗组能够显著下调这5种靶蛋白（BDKRB1、EDN1、MMP2、TLR4、VEGFA）的表达;代谢物水平上,与空白对照组相比,3种关键代谢物的表达在混合感染组之间均出现极显著上调（P<0.01）。而与混合感染组相比,NCMC治疗组的多巴胺和γ-氨基丁酸表达量显著降低（P<0.05）;体外分子对接模拟结果体现了中药复方多靶点、多途径的特点,其中得分最低的化合物为丹酚酸（-10.1 kcal/mol）、甘草素（-9.3 kcal/mol）和异甘草素（-8.7 kcal/mol）,故推测它们与靶点蛋白活性位点的结合潜力最大。（5）NCMC水提物的非靶向代谢组学研究与指纹图谱的建立为了明确NCMC的作用物质基础,本研究对其进行了非靶向代谢组学分析并构建了指纹图谱。UPLC-QTOF-MS/MS在接收端检测到260种化合物,其中包括黄酮类化合物85个,有机酸类化合物64个,苯丙素类化合物17个等。为了明确NCMC中的主要成分,从正负离子模式下的总离子流图中筛选得到了21个含量较高的有效物质,用于体外分子对接模拟。釆用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”进行相似度计算,结果显示各批次NCMC水提物的相似度均在0.9-1.0之间,说明提取工艺稳定,并且利用指纹图谱相似度可以较好地评价其质量。（6）NCMC提取工艺的优化采用正交设计法配合响应面分析,进一步对NCMC的提取工艺进行优化。使用Design-expert软件进行优化预测,结果显示,当提取温度为89.075℃时,液料比为20.264:1,提取时间为3.208 h时,预测最佳OD值为0.753。考虑到生产操作的便利性,并通过单因素考察、响应面分析、提取次数的考察,最终确定NCMC的最优提取工艺为:提取温度89℃,液料比20:1,提取时间3.2 h,提取次数为2次。（7）NCMC颗粒剂的制备工艺研究采用正交实验优化NCMC的制备工艺,发现主辅比对颗粒剂的成型性有显著影响。本研究得出NCMC颗粒剂的最佳制备条件,即干膏粉和辅料比例1:1.5混合（辅料由蔗糖与淀粉1:1混合制备）,PVP浓度为4%,乙醇浓度为80%。综上所述,本研究运用转录组学和代谢组学方法,挖掘MG与E.coli混合感染的靶点网络,并通过关键靶点与中药网络的映射,对中药进行反向筛选,再利用均匀试验设计优化复方中药配比。根据多组学联合分析网络,从多个维度对该复方中药进行靶向验证,揭示其多靶点-多途径的靶向作用。同时,为了明确该复方中药的药效物质基础,本研究对其进行了非靶向代谢组学分析和指纹图谱的构建,并进行提取工艺和颗粒剂制备工艺的优化和验证,为兽医临床治疗呼吸系统疾病的药物开发奠定基础。