研究背景与目的:肺癌已成为人类头号癌症杀手。我国肺癌的患病率和死亡率仍在不断攀升。在过去几十年,随着手术技术的进步,放化疗治疗,针对表皮生长因子(epithelial growth factor receptor,EGFR)突变的络氨酸激酶抑制剂的使用,肺癌的治疗效果有一定改善,但其总的5年生存率仍小于15%。因此,探索肺癌治疗新方法仍具有迫切的现实意义。肺癌免疫基因治疗是近年来研究的热点之一。肿瘤免疫基因治疗的重要策略之一,是通过核酸分子克隆技术,将特定外源性抗原基因转入肿瘤细胞,使其表达外源性抗原,激活机体免疫系统,杀伤肿瘤细胞。超抗原是由细菌、病毒、寄生虫等分泌一类小分子蛋白质,微量抗原就能强烈激活免疫系统,促进免疫效应细胞的增殖,同时释放免疫细胞因子。葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal enterotoxins,SEs)是发现最早、研究最广泛的超抗原之一,其有多达几十种亚型,诸如SEA、SEB、SEC等,SEB为最常见的亚型之一。SEs作为一类细菌性外毒素,是葡萄球菌感染导致的各种炎性症状的主要原因,这些症状包括发热、腹泻以至感染性休克。不过,近年来也有研究显示,因其强抗原性,SEs可能在肿瘤的免疫治疗中发挥作用。然而,也有研究,SEs的强抗原性可以引入肿瘤细胞中并使其表达。本研究将构建SEB基因表达载体,并研究其对Lewis肺癌荷瘤小鼠的治疗作用。从而探讨以SEB为目的基因的肺癌免疫基因治疗的可行性和具体方法。方法:1.以Gen Bank中SEB基因c DNA序列为模板,密码子优化后,通过化学合成的方法获得目的基因SEB序列,同时设计用于PCR扩增SEB基因的引物,正向引物序列为:5,-AAGTATCTAGAGATGCCACCATGTACAACAGACTCTTCGTCAGCC-3,;反向引物::5’-GCCGAGGATCCTCACTTCTTCTTAGTTGTCAGGTATA-3。引物的5,端分别设计有Xba I(TCTAGA)、Bam HI(GGATCC)酶切位点。2.通过核酸分子克隆技术将SEB基因克隆到质粒PCDH-CMV-GFP中,构建成SEB表达质粒PCDH-SEB-GFP;并用测序方法和酶切方法进行鉴定。3.用脂质体将构建的PCDH-SEB-GFP重组质粒转染体外培养的小鼠Lewis肺癌细胞,并用Western Blot检测转染细胞中SEB蛋白的表达情况。4.将小鼠Lewis肺癌细胞接种到C57小鼠右侧腋下(3×106个细胞/只),当肿瘤体积约为50mm3时,将小鼠分为实验组、阴性对照组和空白对照组,每组6只小鼠。实验组小鼠瘤内注射PCDH-SEB-GFP质粒,阴性对照组瘤内注射空载质粒PCDH-CMV-GFP,空白对照组注射等体积的磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)。质粒注射每3天一次,共3次,每次质粒用量为20ug,脂质体20ul,用无血清培养基调整至100ul。每2天用游标卡尺测量肿瘤的长径和短径,计算瘤体体积,绘制肿瘤生长曲线,最后一次质粒注射后2天,剥出眼球采血,并处死小鼠,完整剥离肿瘤块,测量肿瘤长径和短径,据此计算瘤体体积,比较各组小鼠瘤体体积;用电子天平称量肿瘤质量,比较各组小鼠平均瘤重的差异。5.取各组小鼠肿瘤组织作常规HE染色,观察肿瘤组织有无坏死,以及有无炎细胞浸润;用免疫组化方法检测肿瘤组织中SEB表达情况;酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法检测各组小鼠血清中细胞因子γ-干扰素(Interferon-γ,IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的浓度。结果:1、本研究合成的SEB基因长度为801bp,通过琼脂糖凝胶电泳、基因测序鉴定,基因大小及序列与预期结果完全一致。2、成功构建SEB基因表达质粒,测序和酶切鉴定结果与预期结果一致。3、用脂质体方法将PCDH-SEB-GFP和PCDH-CMV-GFP质粒分别转染小鼠Lewis肺癌细胞,24小时后,部分细胞内可见绿色荧光,转染效率约40%;Western blot实验结果显示,转染PCDH-SEB-GFP质粒的Lewis肺癌细胞中有SEB蛋白表达,而转染空载体PCDH-CMV-GFP质粒的Lewis肺癌细胞及空白组(未转染)无SEB蛋白表达。4、成功构建Lewis肺癌细胞C57小鼠肿瘤模型,小鼠成瘤率100%,成瘤期间小鼠无死亡。实验组(瘤内注射PCDH-SEB-GFP质粒)小鼠平均瘤体体积、瘤体质量小于对照组,空白组小鼠瘤体总体积、质量明显大于其余2组。5、HE染色显示实验组所有小鼠肿瘤剖面见出血、坏死区,阴性对照组少数肿瘤可见灶性小坏死区,空白组肿瘤无明显坏死区域;实验组和阴性对照组有炎性细胞浸润,其中实验组更明显,空白对照组无明显炎细胞浸润;免疫组化实验显示,实验组部分肿瘤细胞表达SEB,其余两组肿瘤内无表达SEB细胞;ELISA结果提示各组细胞因子水平无明显差异。结论:1、通过质粒脂质体转染方法,超抗原SEB原核细菌基因能在Lewis肺癌细胞中表达。2、超抗原SEB基因能抑制小鼠肿瘤生长。