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1.1背景和目的URG11在肝癌、胃癌、肺癌、甲状腺癌、膀胱癌等肿瘤组织证实比正常组织表达高[1-5],同时也在细胞生长增殖、细胞黏附、迁移、淋巴细胞转移、以及信号通路转导都有关键作用[6-9]。有研究通过si RNA技术干扰胃癌细胞URG11的表达,胃癌细胞的增殖和克隆形成能力受到明显抑制,而且还可显著削弱其在体外转移和侵袭能力,以及抑制在动物体内的成瘤性和生物学行为[10-14],肿瘤的生物学行为明显受到抑制。经过我们前期研究,证实了URG11在前列腺癌中比正常前列腺组织表达有差异,并且URG11表达强度与其在癌症的病理等级、分化程度、TNM及是否转移有密切关联。在前列腺癌细胞细胞系中URG11 m RNA及蛋白表达明显高于前列腺上皮细胞,且有显著性差异,在LNCa P系中表达异常最显著[15]。然而URG11在前列腺癌细胞生物学功能的影响尚未阐述,RNA干扰(RNAi)是一种新兴的的基因诊治方法,是指利用小RNA序列抑制特定基因信号序列,利用治疗序列的si RNA使细胞出现特定基因缺失,以达到某些实验或治疗目的,在肿瘤的基因诊治中有光明前途[10-14]。本课题拟拟运用细胞转染(慢病毒质粒)、Real-time-PCR和Western blot检测沉默URG11在前列腺癌细胞(LNCa P细胞系)表达特性及MTS/CCK-8法、流式检测技术、细胞迁移实验(划痕检测)及Transwell检测发探究沉默URG11基因后对于LNCa P细胞增殖、凋亡及侵袭力的生物学行为的改变影响,本研究采用RNAi方法干扰沉默URG11在前列腺癌细胞的中表达,明确其在PCa中发生、发展作用功能,阐明URG11在PCa中发病变机制,证实URG11基因可以作为PCa的基因治疗提供了一个新的潜在靶点,进一步证实URG11在PCa表达特性及基因靶向诊治有效性,为治疗PCa基因治疗提供新的路线和理论基础。1.2方法1.细胞培养,设计URG11si RNA干扰序列片段及反密码链(由sigma公司提供)、通过通过细胞转染技术筛选最合适的URG11si RNA及抑制适合浓度。根据文献我们设计URG11si RNA干扰片段(3对),构建含URG11si RNA慢病毒质粒载体,将慢病毒载体质粒与LNCa P细胞混合培养,用慢病毒质粒感染LNCa P细胞,Real-time-PCR和Western blot鉴定有效的干扰载体及合适浓度。2.培养沉默良好的URG11的前列腺癌细胞株。利用筛选出URG11si RNA特异性干扰片段的质粒感染LNCa P细胞,用含空载质粒体的做对照,通过Real-time-PCR和Western blot测定干扰后URG11基因m RNA在细胞中的表达。3.沉默URG11对PCa细胞生物学行为改变的影响。MTS/CCK-8法检测沉默后列腺癌细胞增殖;FCM检测细胞方法检测沉默后生长周期及凋亡程度;迁移实验及Transwell小室检测沉默后侵袭及转移能力等其他生物学行为。1.3结果1.筛选URG11siRNA特异性干扰片段通过由sigma公司提供干扰序列片段及反密码链SASI-Hs01-00182412、SASI-Hs01-00182413、SASI-Hs01-0018241和空白UUCUCCGAACGUGUCACGUTT转染URG11高表达的前列腺癌LNCa P细胞,利用Real-time-PCR、Western blot及RNA Structure软件分析得出三条干扰片段各个浓度的URG11 m RNA表达能力显示:SASI-Hs01-00182413(50n M/ul)对细胞URG11 m RNA抑制能力是最高的,△Ct值分别为30.54±0.18、30.24±0.15、430.39±0.24;经2-△△Ct法计算处理,经过与空白组的对比,LNCa P前列腺癌细胞中URG11 m RNA表达抑制率高达78.25%,经方差分析F=952.12,P<0.000,按α=0.05,具有统计学意义,三个干扰片段中SASI-Hs01-00182413(50n M/ul)具有良好的抑制URG11效果,SASI-Hs01-00182413片段干扰效率最高、最稳定及最有效浓度50n M/ul。2.培养沉默良好的URG11的前列腺癌细胞株将筛选的有效URG11si RNA干扰片段构建质粒转染LNCa P细胞株,Real-time-PCR和WB检测沉默后的LNCa P的细胞株,在LNCa P细胞URG11 m RNA抑制能力是最高的,△Ct值分别为31.62±0.15、30.76±0.11、31.19±0.18;经2-△△Ct法计算处理,经过与空白组的对比,LNCa P前列腺癌细胞中URG11 m RNA表达抑制率高达78.72%,在PC3前列腺癌细胞系抑制率为62.01%。根据干扰后的抑制效果,筛选的URG11si RNA干扰片段及其浓度复合我们要求,经过转染细胞后也能很好抑制前列腺癌细胞,两个细胞系中URG11 m RNA明显降低,经方差分析F=867.28,P<0.000,具有统计学意义。Westernblot检测实验组与对照组对比OD值(95.1285/1993.015),通过上述实验证实了沉默内源性LNCa P的前列腺癌细胞株成功建立。3..MTS/CCK-8法检测沉默后的LNCa P细胞增殖通过MTS/CCK-8法检检测沉默后的LNCa P细胞,与对照组比较,从表5中,我们可以判断出在0h时LNCa P细胞对URG11增殖敏感性,经过配对t检验,t=0.300;p=0.266,,按α=0.05,没有统计学意义;经过沉默24h/48h/72h后,,表7中经过软件的计算,可以经过沉默24h/48h/72h后实验组的抑制率对比:7.15%;8.75%;10.75%,对照组中-0.60%;-0.49%;-0.21%,经过配对t检验,经过配对t检验,t值分别为:3.72,p<0.05,按α=0.05,具有统计学意义,通过比较,证实了通过URG11si RNA特异性干扰片段沉默URG11后LNCa P细胞增殖受到抑制。4.FCM分析沉默后的LNCa P细胞的细胞周期和凋亡指数通过流式细胞仪分析沉默后LNCa P细胞的细胞周期和凋亡指数,与对照组比较,经过转染沉默后的前列腺癌细胞培育48/72h后,实验组停留在G1期的百分比分别为:64.13%;66.98%,在四倍体G2及最终分裂期M期细胞百分比:10.38%、8.14%,对于对照组分析,停留在G1期的百分比分别为:55.94%;53.39%,在四倍体G2及最终分裂期M期细胞百分比:11.28%;9.25%,经过配对t检验,p<0.05,按α=0.05,经过转染沉默后的前列腺癌细胞培育48/72h后,实验组在分析软件上UR+LR细胞百分比分别为:8.48%;8.83%,对于对照组分析,UR+LR细胞百分比分别为:1.47%;1.55%,经过配对t检验,t值分别为:6.424;6.357,各组p<0.05,按α=0.05,具有统计学意义,在凋亡早晚期分析中,沉默48h后前列腺癌细胞分别为:2.52%;5.96%,沉默72h后前列腺癌细胞分别为:2.95%;5.88%,经过配对t检验,p>0.05,我们可以认为无统计学意义,通过流式细胞仪分分析数据可以证实通过URG11si RNA特异性干扰片段沉默URG11后LNCa P细胞生长受到抑制,LNCaP细胞凋亡率增加。5.Transwell小室检测侵袭实验和细胞迁移实验与对照组比较,经过URG11si RNA干扰片段沉默后前列腺癌细胞在0h、6h、24h、48h的细胞侵袭转移分别为:423.53±16.16;420.06±8.4;408.47±16.07;391.46±21.05,对照组前列腺癌细胞在0h、6h、24h、48h的细胞迁移分别为:529.41±12.09;518.48±8.62;451.22±48.19;393.07±15.33;转算为迁移率,实验组分别为:0.00%;0.82%;3.56%;7.57%,对照组迁移率分别为0.00%;2.06%;14.77%;25.5%,,经过配对t检验,t值分别为:3.786;5.234;5.681,各组p<0.05,按α=0.05,具有统计学意义;经过沉默后的.LNCa P细胞迁移数目明显比对照组少,经过URG11si RNA转染48h后,6组实验组细胞中平均迁移数目为(mean±s.d):75.17±17.12个;6组对照组细胞中平均迁移数目为(mean±s.d):164.33±20.03个,经过配对t检验,t值为:6.73,各组p<0.05,按α=0.05,具有统计学意义;转染48h后,6组实验组细胞中平均穿孔数目为(mean±s.d):142.83±10.91个;6组对照组细胞中平均穿孔数目为(mean±s.d):234±8.29个,经过配对t检验,t值为:4.023.p<0.05,按α=0.05,具有统计学意义,经过沉默后的前列腺癌细胞转移、侵袭能力明显降低,也证实了干扰片段的沉默抑制作用。1.4结论经过URG11si RNA干扰后沉默的LNCa P细胞在增殖速度、分裂、侵袭能力下降;加快凋亡;肿瘤生物学行为改变,证实URG11si RNA有效性,URG11可能是促进前列腺癌细胞增殖、运动、侵袭和转移等功能的潜在基因。1.5本研究的创新之处通过前期研究,前列腺癌细胞URG11 m RNA蛋白表达水与良性前列腺组织有显著性差异,尚未有文章对于URG11在前列腺癌生物行为及沉默URG11后的研究,本研究通过筛选实验等到URG11si RNA有效有效干扰片段SASI-Hs01-00182413及有效浓度50n M/ul,拟运用细胞转染(慢病毒质粒)、Real-time-PCR和Western blot检测沉默URG11在LNCa P细胞表达特性及MTS/CCK-8法检测沉默后细胞增殖、FCM检测细胞凋亡及周期、Transwell细胞迁移、侵袭能力等生物学行为,检验沉默URG11基因对前列腺癌细胞生物学性改变,明确URG11基因在LNCa P细胞的功能。实验证实了URG11基因可能时前列腺癌细胞治疗潜在的基因。