【摘 要】
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纤维素是世界上最丰富的可再生资源,因其结构复杂很难被微生物直接利用,导致纤维素的生物降解始终难以满足工业化生产的需求。自1998年第一次发现持续性内切葡聚糖酶以来,众多专家学者对持续性内切酶降解纤维素的作用机理进行了探讨,取得了一定的进展。本课题组在前期工作中,从纤维素降解菌株Sporocytophaga sp.CX11的蛋白质数据库中筛选出一个预测为持续性内切酶的蛋白质----Sm Cel5A,
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纤维素是世界上最丰富的可再生资源,因其结构复杂很难被微生物直接利用,导致纤维素的生物降解始终难以满足工业化生产的需求。自1998年第一次发现持续性内切葡聚糖酶以来,众多专家学者对持续性内切酶降解纤维素的作用机理进行了探讨,取得了一定的进展。本课题组在前期工作中,从纤维素降解菌株Sporocytophaga sp.CX11的蛋白质数据库中筛选出一个预测为持续性内切酶的蛋白质----Sm Cel5A,该蛋白质结构简单,仅由分泌信号肽和糖苷水解酶第五家族催化结构域组成,本论文主要围绕Sm Cel5A及其突变体的功能展开研究。论文首先从Sporocytophaga sp.CX11基因组中克隆了Sm Cel5A基因,并在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达,利用亲和层析纯化得到电泳纯的Sm Cel5A蛋白。对重组蛋白Sm Cel5A进行了一系列酶学性质表征:Sm Cel5A对于羧甲基纤维素钠（CMC）的酶活高达281.74±0.01 U/mg;降解滤纸时,随着反应时间的延长（5-180min）,生成的可溶性糖与不可溶性糖的比例也逐渐提高（2.32到11.22）,在短时间内（1 min）可迅速降低CMC粘度;Sm Cel5A的最小作用底物为纤维三糖。为了进一步明确Sm Cel5A活性中心的关键氨基酸位点,分别构建了W174A和W205A两个突变体。与重组蛋白Sm Cel5A相比,W174A的突变使得酶活几乎完全丧失,而W205A的酶活比Sm Cel5A略有下降;W205A水解滤纸时,起初生成可溶性糖与不可溶性糖的比例高于Sm Cel5A,持续水解能力略高于Sm Cel5A。定点突变结果表明,174和205两个位点在持续性内切酶Sm Cel5A降解滤纸纤维素的过程中起关键作用,其中W174是酶催化纤维素底物的关键氨基酸残基,而W205位点可能直接影响Sm Cel5A持续水解能力。
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