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第一部分 儿童原发性肾病综合征尿源干细胞分离培养技术研究 目的:研究探讨建立儿童原发性肾病综合征尿源干细胞(urine-derived stem cells from pediatric patients with Primary Nephrotic Syndrome;p-USCs)分离培养技术方法。 方法:通过离心、贴壁等方法体外分离培养p-USCs;使用光学显微镜观察细胞形态;利用CCK-8试剂盒绘制细胞生长曲线;流式细胞术检测细胞周期及p-USCs表面标志物表达;利用茜素红染色及油红O染色检测p-USCs成骨成脂分化潜能。 结果:通过离心、贴壁等方法从 PNS 患儿尿液中成功分离出p-USCs;外观米粒样;呈对数生长;p-USCs表达间充质干细胞表面标志物CD24、CD29、CD73、CD90;少数P-USCs表达CD105;周细胞表面标志物CD146表达均呈阳性;造血干细胞标志物CD34表达均呈阴性;p-USCs经成骨成脂培养基诱导后;茜素红和油红O染色均呈阳性。 结论:以上结果表明;本研究成功建立了PNS患儿p-USCs分离培养的方法;为探讨p-USCs用于儿童PNS早期肾损伤的诊断及难治性肾病的治疗研究提供前期技术方法。 第二部分 儿童原发性肾病综合征尿源干细胞生物学特征研究 目的:探讨原发性肾病综合征患儿尿源干细胞(urine-derived stem cells from Pediatric Patients with Primary Nephrotic Syndromin;p-USCs)生物学特征;比较p-USCs与正常儿童尿源干细胞(urine-derived stem cells from normal children;USCs)差异。分析在患儿体内环境影响下p-USCs的干性是否受损;为进一步利用自身尿源干细胞治疗患儿相关肾脏疾病奠定前期基础。 方法:利用离心、贴壁等方法体外分离培养原发性肾病综合征患儿尿源干细胞(p-USCs)及正常儿童尿源干细胞(USCs);对两者克隆数特点进行比较;使用光学显微镜观察p-USCs及USCs两种细胞形态差异;通过绘制生长曲线及检测细胞倍增时间分析比较两种细胞增殖能力;利用流式细胞术检测两种细胞凋亡、间充质干细胞表面标志物(CD24、CD29、CD34、CD73、CD90、CD105)及周细胞表面标志物(CD146)表达差异;Western blot检测两种细胞Pax2表达及自噬水平。 结果:1、收集正常儿童尿源干细胞(USCs)15例;PNS尿源干细胞(p-USCs)14例。2、总克隆数/100ml 尿液:与正常儿童(14.85 ±10.85)相比;PNS单纯型患儿(52.13±62.52)有增加趋势;但无统计学差异;PNS肾炎型患儿(455.50±190.80)增加更明显(P<0.001); PNS肾炎型较PNS单纯型患儿显著增加(P<0.001);USCs克隆/100ml尿液:与正常儿童(4.25±3.60)相比;PNS单纯型患儿(21.46±21.86)有增加趋势;但无统计学差异;PNS肾炎型患儿(242.80±156.10)增加更明显( P<0.001 ); PNS 肾炎型较 PNS 单纯型患儿显著增加(P<0.001)。与正常儿童相比;PNS肾炎型患儿首次出现USCs克隆时间提前(P<0.05)。3、PNS单纯型组患儿尿液中发现两种形态USCs:p-USCs Ⅰ、p-USCs Ⅱ;p-USCsⅠ指形态与正常USCs相似;呈米粒样;胞体较小;排列紧密;p-USCs Ⅱ指少数细胞胞体可见少量空泡;胞体较大;散在排列。USCs、p-USCs Ⅰ及 p-USCs Ⅱ最多可传代数分别是:11代、8代及5代。4、与USCs相比较;p-USCs (p-USCsⅠ及 p-USCs Ⅱ)增殖减弱; p-USCsⅡ减弱更加明显。5、与 USCs相比较;p-USC(p-USCsⅠ及p-USCs Ⅱ)细胞凋亡率、间充质干细胞及周细胞表面标志物表达无明显差异。6、与USCs相比较;p-USCs Ⅰ表达Pax2有下降趋势;p-USCs Ⅱ表达Pax2减少更明显(P<0.01);且p-USCs Ⅱ较p-USCs Ⅰ表达Pax2减少更显著(P<0.01)。7、与USCs相比较;p-USCs Ⅰ及p-USCs Ⅱ自噬水平下降(均P<0.01)。 结论:1、PNS患儿尿源干细胞原代克隆数增加;提示尿源干细胞克隆数多少可能与肾脏疾病严重程度有关。2、PNS单纯型患儿体内环境可能影响PNS患儿尿源干细胞(p-USCs)增殖及自我更新能力;不影响p-USCs凋亡率、MSCs及周细胞标志物表达。3、受PNS单纯型患儿体内影响;部分 p-USCs Pax2 表达水平及自噬水平下调;可能参与影响p-USCs增殖及自我更新能力。4、p-USCs单纯型患儿体内存在不同损伤程度的尿源干细胞:p-USC Ⅰ与p-USCs Ⅱ。p-USC Ⅰ增殖能力较良好及Pax2表达水平较高;Pax2可能作为反应p-USC增殖状态的筛选指标之一。