研究背景：　　肺癌是目前世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，其中约85%是非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)。由于非小细胞肺癌的转移及侵袭等生物学特性，很多患者在手术后仍会出现局部复发或远处转移。因此化疗在肺癌治疗中占有重要地位，但由于肿瘤细胞的多药耐药(multidrug resistance，MDR)，常常导致化疗失败。细胞内药物的外排在肿瘤多药耐药作用中具有十分重要的作用。研究肿瘤细胞内化疗药物外排的机制和影响因素，有效阻断或抑制化疗药物的外排，最终可以达到提高化疗效果的目的。研究发现，ATP结合盒转运体G2（ATP-binding cassette G2，ABCG2）具有促进细胞内化疗药物外排的作用。空泡型ATP酶（Vacuolar-H＋-ATPase，V-ATPase，）是细胞膜上H+主动转运相关蛋白，能维持肿瘤细胞内pH的相对稳定，外排H+进而升高细胞内的pH值能够显著抑制化疗药物活性。　　高压电场（High voltage electric field）作用于肿瘤细胞，可以导致细胞膜发生可逆或不可逆的电穿孔作用(Electroporation)，造成细胞内外电解质平衡的紊乱。有研究证实，高压电场处理会干扰细胞蛋白表达，也会影响细胞膜表面功能蛋白活性。本实验旨在明确高压电场处理对肺腺癌A549细胞化疗的影响以及可能机制。　　目的：　　1.明确高压电场处理对肺腺癌A549细胞活力、粘附、迁移的影响。　　2.明确高压电场处理对肺腺癌A549细胞化疗敏感性的影响　　3.明确ABCG2介导高压电场增强化疗敏感性的内在机制　　4.明确V-ATPase介导高压电场增强化疗敏感性的内在机制。　　方法：　　1.首先对A549细胞施加梯度强度的高压电场，细胞分为对照组、500 V/cm组、1000 V/cm、1500 V/cm组。CCK8法检测A549细胞活力、粘附实验检测A549细胞粘附能力，划痕实验检测A549细胞迁移能力。　　2.首先根据第一部分实验确定适宜的电场强度。选择阿霉素、多西他赛、顺铂、依托泊苷、吉西他滨、紫杉醇6种临床常用化疗药，确定适宜的损伤浓度。然后联合应用高压电场与化疗药物，检测细胞活力，并与单纯化疗药物处理组进行比较，明确高压电场是否增强了化疗药物的毒性。进而选取阿霉素进一步研究，检测凋亡相关指标，验证活力检测的结果。最后关注电场处理对ABCG2蛋白的影响。　　3.在明确电场处理改变 ABCG2表达的基础上，进一步过表达或敲减 ABCG2蛋白，检测细胞活力及凋亡水平，明确高压电场是否通过影响ABCG2表达情况影响A549细胞对阿霉素敏感性的。细胞分为电场处理组、电场+阿霉素组、ABCG2 siRNA+电场+阿霉素组、ABCG2过表达+电场+阿霉素组，检测细胞活力、Caspase9、Caspase3、Bcl2、Bax等指标，明确ABCG2在该过程中的作用。　　4.进一步关注电场处理对V-ATPase活性的影响，以及调控V-ATPase活性是否影响高压电场对阿霉素毒性的增强作用。首先将细胞分为对照组、500 V/cm组、1000 V/cm和1500 V/cm组，检测V-ATPase活性。进而将细胞分为阿霉素组、电场+阿霉素组、巴弗洛霉素A1+阿霉素组、巴弗洛霉素A1+电场+阿霉素组，检测细胞活力、Caspase9、Caspase3、Bcl2、Bax等指标，明确V-ATPase在该过程中的作用。　　结果：　　1.500 V/cm组、1000 V/cm、1500 V/cm组的细胞活力分别为对照组的（97.4±6.7）%、（95.2±5.4）%和（67.2±4.9）%，细胞粘附能力下降到对照组的（87.3±7.8）%、（67.4±6.9）%和（57.2±4.2）%，细胞间距增加到对照组的（137.1±8.9）%、（159.2±11.3）%和（196.4±14.5）%。　　2.首先筛选出适宜的化疗药物浓度：阿霉素2.5μM，多西他赛2μM，顺铂2μM，依托泊苷1μM，吉西他滨0.15μM，紫杉醇0.08μM。联合高压电场处理后化疗药物损伤强度优于单纯化疗药物处理。以阿霉素为例，进一步检测Caspase9、Caspase3、Bcl2、Bax发现，电场与阿霉素联合处理显著上调了Caspase9、Caspase3活性，上调了Bax表达，下调了Bcl2表达。ABCG2检测结果显示，电场处理后ABCG2的mRNA和蛋白水平均下降。　　3.首先RT-PCR和Western blot法明确ABCG2过表达和敲除效率。在此基础上给予各组相应处理发现，ABCG2过表达逆转了高压电场对阿霉素的毒性增强作用，而ABCG2 siRNA处理增强了高压电场对阿霉素的毒性增强作用。　　4. V-ATPase活性检测发现，500 V/cm强度的高压电场对V-ATPase活性影响不大，而1000 V/cm和1500 V/cm强度的高压电场显著降低了V-ATPase活性。巴弗洛霉素A1联合阿霉素处理显著抑制了细胞活力，且抑制作用强于单纯阿霉素组。进一步检测凋亡指标发现，巴弗洛霉素A1处理对Caspase3、Caspase9活性以及Bax、Bcl2表达没有显著影响，而联合应用巴弗洛霉素A1和阿霉素则显著上调了Caspase3、Caspase9活性以及Bax的表达，下调了Bcl2表达，与单纯阿霉素处理组比较有统计学差异。　　结论：　　1.高压电场处理可以抑制肺腺癌A549细胞的粘附和迁移能力　　2.1000 V/cm的高压电场处理对肺腺癌A549细胞活力没有显著影响，但是显著增强了肺腺癌A549细胞对化疗药物的敏感性。　　3.电场处理特异或非特异地抑制了ABCG2的表达，调控ABCG2表达可逆转或增强高压电场的作用。提示高压电场对阿霉素毒性的强化作用可能部分由ABCG2介导。　　4.电场处理抑制了V-ATPase活性，进一步抑制V-ATPase活性后高压电场作用进一步增强。提示高压电场对阿霉素毒性的强化作用可能部分由V-ATPase介导。