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水通道4(aquaporin4,AQP4)是脑内表达最为丰富的水通道蛋白,在中枢神经系统水代谢和渗透压调节中占据主导地位。AQP4不仅是脑内一种特异性的水转运通道,而且与星形胶质细胞及神经元功能关系密切,参与脑内神经递质传导等功能的调节。研究发现,AQP4基因敲除能够增强吗啡镇痛、显著抑制吗啡慢性处理所致的镇痛耐受和躯体依赖,这可能与谷氨酸转运体-1(glutamate transport-1, GLT-1)有关,因此本研究旨在探讨AQP4基因敲除对吗啡依赖小鼠谷氨酸系统的影响。 首先在吗啡慢性处理小鼠模型上观察AQP4基因敲除对小鼠大脑和不同脑区谷氨酸转运体蛋白表达的影响。蛋白免疫印迹实验结果显示,(1)AQP4基因敲除导致 GLT-1的基础表达水平在大脑及前额叶皮层、纹状体和小脑各脑区(海马除外)表现出明显下调,而GLAST和EAAC1的基础表达水平不变;(2)吗啡慢性处理显著下调野生型小鼠大脑及各脑区(海马除外)AQP4的蛋白表达水平;(3)吗啡慢性处理显著下调野生型小鼠大脑及各脑区(海马除外)GLT1的蛋白表达水平,而对AQP4基因敲除小鼠GLT1的蛋白表达水平无显著影响;(4)吗啡慢性处理既不影响野生型,也不影响AQP4基因敲除小鼠脑内另外两种谷氨酸转运体(GLAST和EAAC1)的蛋白表达水平。通过本部分研究,我们可得出如下结论:AQP4基因敲除引起小鼠脑内GLT-1基础表达水平下调;与野生型小鼠吗啡慢性处理所致脑内GLT-1表达水平的下调不同,AQP4基因敲除使吗啡依赖小鼠脑内GLT-1表达水平维持一种稳定状态。 为近一步观察AQP4基因敲除抑制吗啡慢性处理所致脑内GLT-1表达水平的下调是否会对谷氨酸重摄取能力产生影响。本部分研究应用离体脑片[3H]-glutamate重摄取的方法对慢性吗啡处理小鼠各脑区谷氨酸重摄取能力进行测定。结果显示,(1)AQP4基因敲除显著降低前额叶皮层、纹状体、海马和小脑等脑区基础状态下的谷氨酸重摄取能力;(2)与生理盐水对照组比较,吗啡慢性处理显著降低野生型小鼠前额叶皮层脑片谷氨酸重摄取能力,而对于 AQP4基因敲除小鼠前额叶皮层脑片谷氨酸重摄取能力则没有影响;(3)对于纹状体、海马及小脑脑区,吗啡慢性处理既不能影响野生型也不能影响 AQP4基因敲除小鼠脑片的谷氨酸重摄取能力。通过本部分研究,我们发现:AQP4基因敲除引起小鼠脑内基础状态下谷氨酸重摄取水平降低,与野生型小鼠吗啡慢性处理所致小鼠前额叶皮层谷氨酸重摄取水平的降低不同,AQP4基因敲除使小鼠谷氨酸重摄取建立了新的平衡,并且不能被吗啡慢性处理打破。 为确认GLT-1在AQP4基因敲除小鼠吗啡依赖过程中的作用,我们在上述实验的基础上采用侧脑室注射给药的方式,给予GLT-1特异性抑制剂二氢卡因酸盐(dihydrokainate,DHK)抑制其谷氨酸重摄取能力,观察DHK对AQP4基因敲除型小鼠吗啡躯体依赖形成的影响。实验结果显示,(1)与生理盐水(normal saline, NS)伴随侧脑室注射人工脑脊液(artifical cerebrospinal fluid,ACSF)(ACSF+NS)组相比,吗啡伴随侧脑室注射ACSF(ACSF+Mor)慢性处理经纳络酮催促后未观察到戒断症状,戒断积分及体重变化与ACSF+NS组比较无统计学差异;(2)生理盐水伴随侧脑室注射DHK(DHK+NS)慢性处理经纳络酮催促后未观察到戒断症状,戒断积分及体重变化与ACSF+NS组比较无统计学差异;(3)吗啡伴随侧脑室注射DHK(DHK+ Mor)慢性处理经纳络酮催促诱发出典型的戒断症状,包括扭体和直立等,戒断积分及体重变化与ACSF+NS、DHK+NS、ACSF+Mor组比较均有统计学差异,提示DHK+Mor组小鼠形成了吗啡躯体依赖。通过本部分研究,我们发现:抑制脑内GLT-1功能能够增强AQP4基因敲除小鼠吗啡躯体依赖的形成。 为进一步确认AQP4基因敲除引起的GLT-1表达水平和谷氨酸重摄取能力降低对突触间隙谷氨酸水平的影响,我们采用清醒动物脑微透析技术观察了AQP4基因敲除对吗啡慢性处理及纳络酮催促戒断小鼠内侧前额叶皮层(medial prefrontal cortex,mPFC)氨基酸水平的影响。结果显示,(1)吗啡慢性处理末次给药引起野生型小鼠mPFC内兴奋性氨基酸(Glu、Asp)和抑制性氨基酸(GABA、Gly)水平显著降低,而对AQP4基因敲除型小鼠则没有影响;(2)吗啡慢性处理经纳络酮催促戒断引起野生型小鼠mPFC内兴奋性氨基酸(Glu、Asp)水平显著升高、抑制性氨基酸(GABA、Gly)水平不变,而对AQP4基因敲除小鼠mPFC内兴奋性氨基酸和抑制性氨基酸水平均没有影响。通过本部分研究,我们发现:与野生型小鼠吗啡慢性处理所致mPFC内兴奋性氨基酸(Glu、Asp)和抑制性氨基酸(GABA、Gly)水平的降低,纳络酮催促戒断所致小鼠mPFC内兴奋性氨基酸(Glu、Asp)水平的升高不同,AQP4基因敲除小鼠mPFC内氨基酸水平始终处于一种功能稳态。 在确认AQP4基因敲除对吗啡慢性处理及纳络酮催促戒断小鼠mPFC氨基酸含量的影响的基础上,我们采用Real Time PCR的方法观察AQP4基因敲除对吗啡慢性处理小鼠PFC内NMDA受体亚基mRNA表达的影响。结果显示,(1)AQP4基因敲除对小鼠PFC内NMDA受体NR1、NR2A和NR2B亚基mRNA的基础表达水平均没有影响;(2)吗啡慢性处理导致野生型小鼠PFC内NMDA受体NR1、NR2A和NR2B亚基mRNA的表达水平显著升高,而对AQP4基因敲除小鼠则没有影响。通过本部分研究,我们发现:AQP4基因敲除对小鼠PFC内NMDA受体NR1、NR2A和NR2B亚基mRNA的基础表达水平没有影响,与野生型小鼠吗啡慢性处理所致PFC内NMDA受体NR1、NR2A和NR2B亚基mRNA表达水平的升高不同,AQP4基因敲除使PFC内NMDA受体表达未发生代偿性适应。 综上所述,AQP4基因敲除通过提高谷氨酸系统功能稳态的维持能力而减弱吗啡依赖,提示AQP4参与吗啡依赖的形成过程,为寻找干预吗啡依赖的生物学手段开拓了新思路。