柑橘CitERF34转录因子的克隆及其抗非生物胁迫的功能研究

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柑橘为芸香科植物,世界上有多达140多个国家种植,其种植面积大,是世界上重要的经济型水果作物之一。在我国拥有丰富的柑橘种质资源与优良品种,其栽培面积与产量也均居世界第一。在柑橘生长发育、开花以及果实成熟等过程中,外界环境如低温、干旱、水涝、盐害等条件都将影响其产量与果实品质,从而影响经济效益。因此,研究柑橘在抵御逆境胁迫中的分子机制以及提高柑橘抗逆性显得尤为重要。植物在面对生物或非生物胁迫时会诱导大量抗逆相关基因表达,其中ERF(Ethylene-responsive factor)是植物所特有的一类转录因子,在其生长发育及逆境胁迫应答过程中发挥着重要作用。相比模式植物,目前对柑橘ERF家族成员的研究报道还很少。因‘资阳’香橙(Citrus junoscv.‘Ziyang’)具有抗病强、耐盐碱以及与接穗亲和性较好等优点,在柑橘产业上被广泛用作砧木;由此,本实验以‘资阳’香橙为研究对象,从中克隆获得CitERF34基因。通过生物信息学分析,初步了解了CitERF34的理化性质、基因结构、系统进化关系等;采用基因表达、遗传转化、亚细胞定位以及生理生化分析等,分析了柑橘CitERF34对不同激素和逆境处理的响应模式以及在不同组织中的表达情况;明确了该基因在细胞中的具体位置,并对其转基因烟草植株进行了抗逆评价。主要实验结果如下:(1)从‘资阳’香橙中克隆获得了CitERF34(ID:Ciclev10032575m),利用生物信息学进行分析,结果显示CitERF34的ORF长度为735 bp,其中含有1个内含子,2个外显子,可编码244个氨基酸,预测蛋白相对分子量为92939.50 D,其理论等电点为5.04,不稳定系数为46.77,脂肪系数为28.12。保守结构域分析结果表明,CitERF34蛋白含有该基因家族特有的保守结构域AP2,且域内含有WLG、YRG和LAYD,第14和第19位分别是丙氨酸和天冬氨酸;聚类分析显示,CitERF34与木薯Me ERF113(Manihot esculenta)、苹果Md ERF113(Malus domestica)和葡萄Vq ERF114(Vitis vinifera)基因的亲缘关系最近,而Me ERF113、Md ERF113和Vq ERF114在生物胁迫中均发挥着重要作用,表明柑橘CitERF34可能与逆境胁迫相关。(2)组织特异性表达结果表明,CitERF34基因在根、茎、叶以及果皮中均有表达,在果皮中表达量最高,根次之,茎中几乎不表达,表明该基因在柑橘及其果实生长发育过程中发挥着重要作用。(3)通过在ABA、ACC和非生物胁迫(干旱、低温与NaCl)处理结果发现,在激素ABA处理下,CitERF34基因在根中的表达受诱导,其表达量上调,而叶片中3 h时表达量上升至峰值,随后在6 h时下降至低于对照水平。在ACC处理后根中的表达量呈显著上调,表达受到诱导;相反,在叶片中其表达受到抑制,随着处理时间延长逐渐下降。非生物胁迫下,CitERF34基因在根系和叶片中的表达均受诱导,其表达量整体呈上升趋势。其中干旱处理下,该基因在根和叶片中的整体表达量较对照的差异更显著,推测该基因可能更大程度地参与调控植物对干旱胁迫的应答模式。综上结果表明CitERF34基因能够响应多种逆境与激素诱导,在植物抗逆过程中发挥着重要作用。(4)亚细胞定位表明,CitERF34蛋白位于细胞核中。构建CitERF34超表达载体,遗传转化烟草,并获得其转基因植株。通过表型和生理生化分析表明,转基因植株在干旱、盐害和低温等非生物胁迫下,体内可溶性糖、脯氨酸含量均高于WT植株,其抗逆相关基因Nt SOD的转录水平升高,表现出一定的抗逆性。
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