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背景与目的大肠癌是严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤之一。在北美、欧洲各国大肠癌的占全部癌症死亡原因的第2位。随着我国国民生活水平的改善,饮食结构的改变,大肠癌的发病率呈逐年升高趋势。目前大肠癌临床治愈率低的主要原因主要是对化疗药物的耐受性和转移性。随着分子生物学的发展,基因治疗给根除癌症带来了新希望。基因治疗的关键在于基因靶点的选择,Survivin基因是凋亡蛋白抑制因子(Inhibitors of apoptosis protein,IAP)家族中的新成员,国内外一些研究认为Survivin作用于各个凋亡途径的汇聚点,直接抑制终末效应蛋白caspase-3和caspase-7,强烈抑制由于二者过度表达诱发的凋亡,是迄今发现最强的凋亡抑制因子。由于Survivin对凋亡的抑制,癌细胞得以继续分裂,造成肿瘤邻近和远隔部位转移灶形成。且Survivin阳性表达的细胞株或患者中,对化疗或放疗抵抗现象普遍。有关研究发现,大肠癌中Survivin基因的阳性率超过60%,而在正常组织和大肠良性肿瘤中几乎无表达,且在Survivin表达阳性的病例中半数以上有远处转移,这说明Survivin基因在大肠癌恶变过程中起这至关重要的作用。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是将与目的基因mRNA序列互补的小的双链RNA导入靶细胞,促使mRNA降解,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型,从而高效特异地阻断体内特定基因表达。在细胞内具有3’端两个核苷酸突出末端的19～23nt的小分子干扰核糖核酸(small interference RNA,siRNA)或短发夹RNA(shot hairpin RNA,shRNA),作为RNAi的中介分子,通过序列互补配对法则特异性降解目的基因,抑制序列特异性的基因表达。RNA干扰技术具有高度序列特异性特征,能够识别正常和变异基因副本问在单个核苷酸上的差别,并在此基础上对正常和变异基因作出区分,最终只“敲除”变异基因,而不影响正常基因的功能。另外,还具有高效性特征,RNAi存在瀑布放大效应,每个细胞仅需几分子siRNA就可产生RNAi效应,并可达到缺失突变体表型的程度。相比普通的siRNA,具有短发卡结构的双链RNA,稳定性比siRNA更好,而且能增加阻断基因表达的时间。本研究应用RNA干扰技术将靶向Survivin基因的siRNA瞬时转染大肠癌离体细胞株Lovo,观察Lovo细胞Survivin基因表达情况后,根据siRNA序列设计、合成shRNA并构建shRNA质粒表达载体,脂质体介导转染Lovo细胞并筛选稳定表达细胞株后,检测稳定表达细胞的生长周期和增殖情况。研究目的在于给大肠癌Survivin基因治疗的可行性提供依据。方法一、设计靶向Survivin基因的siRNA,瞬时转染大肠癌离体细胞Lovo,观察Survivin基因的表达情况1.siRNA的设计应用siRNA设计软件初筛出9对,再进行BLAST分析剔除与其他编码同源性的siRNA,最后经RNA结构分析软件分析将对应的基因序列位于二级结构的siRNA筛除,选出2对靶向Survivin的siRNA(Survivin-siRNA-1和Survivin-siRNA-2)。2.瞬时转染大肠癌Lovo细胞采用脂质体转染技术将Survivin-siRNA转染Lovo细胞,转染72小时后进行相应检测。3.各项指标的检测用real-time RT-PCR技术检测Survivin mRNA的表达量,Western-blot检测Survivin蛋白表达水平,Annexin V-FITC/PI双染经流式细胞仪检测细胞凋亡率,荧光显微镜观察细胞形态,MTT法检测细胞增殖情况。二、构建靶向Survivin基因的shRNA质粒表达载体,转染Lovo细胞并筛选稳定表达细胞株,观察细胞生长周期及增殖的情况1.shRNA质粒表达载体的构建根据siRNA序列设计一段带有loop环的shRNA,并将其克隆至pGenesil-1质粒载体上。采用脂质体转染技术将构建的pGenesil-Survivin-shRNA质粒转染Lovo细胞,并以G418进行稳定表达细胞的筛选,所得稳定表达细胞用于检测。2.各项指标的检测半定量RT-PCR检测Survivin mRNA表达水平,PI染色经流式细胞仪检测细胞生长周期,MTT法检测细胞增殖情况。结果一、瞬时转染1.Survivin mRNA表达的测定结果显示导入设计的siRNA(Survivin-siRNA-1和Survivin-siRNA-2)的Lovo细胞Survivin mRNA表达量仅为未转染的Lovo细胞的1/5309和1/4593。2.Survivin蛋白表达的测定结果显示Survivin-siRNA-1组和Survivin-siRNA-2的Survivin蛋白相对表达量分别为0.565和0.576,均低于未转染Lovo组(0.992)。3.细胞凋亡率的测定结果显示转染72小时后Survivin-siRNA-1组的细胞凋亡率为25.67±2.03%,Survivin-siRNA-2组细胞凋亡率为25.98±0.45%,均显著高于未转染Lovo组的细胞凋亡率(8.8±1.98%)(P值:0.000,F值:102.852)。但转染96小时后两干扰组与未转染组间虽仍有统计学意义但差异已变小(Survivin-siRNA-1组:28.25±2.97%,Survivin-siRNA-2组:29.62±1.31%,未转染组:24.98±2.71%;P值:0.022,F值:5.666)。4.细胞凋亡形态学检测两干扰组可见大量绿色荧光在细胞膜上的早期凋亡细胞,及晚期凋亡细胞核内的红色荧光显示的细胞核固缩或分叶、碎裂状,而未转染组Lovo细胞未见明显荧光。5.细胞增殖的测定结果显示转染后48小时和72小时Survivin-siRNA-1组和Survivin-siRNA-2组的活细胞数显著低于未转染组,以72小时最为明显(Survivin-siRNA-1组:0.581±0.070,Survivin-siRNA-2组:0.681±0.104,未转染组:2.060±0.27;P值:0.000,F值:87.961)。但转染96小时后两干扰组与未转染组间虽仍有统计学意义但差异已变小(Survivin-siRNA-1组:1.909±0.174,Survivin-siRNA-2组:2.107±0.375,未转染组:2.864±0.511;P值:0.002,F值:8.895),并且两干扰组96小时的活细胞数较72小时增长超过2.5倍。6.两对siRNA的对比根据以上检测,显示Survivin-siRNA-1能够比Survivin-siRNA-2更有效的降低Lovo细胞Survivin表达。但由于siRNA在细胞内性质不稳定,所以不利于进一步研究其对Lovo细胞生物学特性的影响。二、稳定转染1.Survivin mRNA表达的测定结果显示稳定表达细胞株pGenesil-Survivin-1组和pGenesil-Survivin-2组Survivin mRNA表达水平比未转染Lovo组分别下降73.6%和50.4%。但是与瞬时转染结果比较发现shRNA质粒的基因沉默效果明显低于siRNA(转染siRNA后Survin mRNA表达量仅为未转染Lovo细胞的数千分之一)。2.细胞生长周期的测定结果显示处于G2/M期的细胞数比率pGenesil-Survivin-1组为50.75±2.51%,pGenesil-Survivin-2组为49.01±3.70%,显著多于未转染组(25.02±4.14%)(P值:0.000,F值:40.258)。3.细胞增殖的测定24、48、72、96和120小时检测结果显示,pGenesil-Survivin-1组和pGenesil-Survivin-2组的活细胞数均显著低于未转染Lovo细胞组,且以pGenesil-Survivin-1组为明显。与瞬时转染检测结果比较发现,shRNA质粒可以使Lovo细胞较长时间处于低增殖状态,而瞬时转染siRNA仅在转染后72小时内使Lovo细胞增殖能力减弱,超过72小时后细胞增殖速度明显变快。4.shRNA质粒表达载体的比较根据以上检测,发现pGenesil-Survivin-1比pGenesil-Survivin-2能更加明显的降低Survivin的表达,同时发生G2/M期阻滞的细胞更多,细胞的增殖力也更弱。结论1.通过siRNA设计软件初筛—BLAST分析—RNA结构分析软件分析这3步进行siRNA设计,是一种快速、简便、有效的方法。2.pGenesil-1是一种含有绿色荧光蛋白(EGFP),Kanar抗性,Neor表达框架和U6启动子的质粒。以其为载体可以将所载基因片断稳定、高效的转染到细胞内。3.应用RNAi技术,将靶向Survivin基因的siRNA及shRNA质粒转染大肠癌细胞(Lovo),能成功的介导Survivin基因沉默,达到靶向封闭Survivin基因的目的,从而使Lovo细胞的凋亡率升高。而稳定表达Survivin基因缺失的Lovo细胞,其增殖能力明显下降。以上结果显示:Survivin基因在大肠癌细胞增殖和凋亡调控中可能起关键性作用,因而以Survivin基因为靶基因的基因治疗对大肠癌可能有效。4.瞬时转染靶向Survivin基因的siRNA可以高效的敲低Lovo细胞的surivivn基因表达,但发挥RNAi的时间较短;而稳定转染shRNA质粒的Lovo细胞,随着长时间的筛选培养,RNAi效果比瞬时转染低,但是其可以使Lovo细胞长时间处于低增殖状态。5.本实验设计的siRNA含有19个碱基,其GC比分别为:Survivin-siRNA-1:42%,Survivin-siRNA-2:37%,均在35-50%之间,完全符合siRNA设计要求,其中Survivin-siRNA-1的RNAi作用更强,考虑原因可能是siRNA的GC比越接近50%,其RNAi的效果越好。