研究背景和目的恶性肿瘤是严重影响人类健康的重要疾病之一,目前对恶性肿瘤的治疗仍然以手术切除、放射治疗、化学治疗为主要手段。手术治疗对早期肿瘤具有良好的治疗效果,但中晚期患者由于多发生局部侵润和远处转移,已失去手术治疗的指针,而放化疗由于其毒副作用大而往往不为患者所接受。因此,有必要寻找一种新的、特异性强的、主要针对于中晚期肿瘤患者的治疗方式,以尽可能地减轻患者的痛苦,延长患者的生命。近年来,以树突状细胞（Dendritic cells, DC）为基础的肿瘤免疫治疗因毒副作用小、特异性强而越来越受到学者们的重视。肿瘤相关抗原（Tumor associated antigen, TAA）与DC的结合是目前以DC为基础的肿瘤免疫治疗的主要方式。目前已发现并克隆了许多肿瘤相关抗原,但这些TAA的组织特异性太强,如AFP来源于肝癌、PSA来源于前列腺癌、CEA来源于消化道及呼吸道肿瘤,以这些抗原为靶位的免疫治疗只能针对表达这些抗原的肿瘤细胞,因此治疗窗太小。因此有必要寻找一种广谱的肿瘤相关抗原用于肿瘤的免疫治疗。理想的肿瘤相关抗原应该具备:（1）在绝大多数肿瘤组织中表达从而可以广泛应用;（2）只表达于肿瘤细胞以避免自身免疫反应;（3）不表达于正常成熟组织以避免免疫耐受;（4）在肿瘤的发生发展过程中具有不可替代的作用,以避免抗原缺失;（5）能诱导足够强度的免疫反应并导致肿瘤消退;（6）同时包含有MHCⅠ和MHCⅡ类分子,从而可诱导CD4+和CD8+ T细胞反应。细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL）介导的特异性细胞免疫在机体抗肿瘤中起着非常重要的作用,能有效激发特异性CTL应答是目前肿瘤免疫治疗的重要研究目标。随着对机体抗肿瘤免疫机制的深入研究,人们已经认识到诱发体内细胞毒T淋巴细胞发挥抗瘤作用的并不是整个肿瘤抗原分子而是与MHC分子结合的短肽即CTL表位（epitopes）,因此,寻找特异性肿瘤抗原及其相应的CTL表位成为肿瘤免疫治疗的热点。肝素酶（Heparanase, Hpa）是目前发现的唯一能够降解细胞外基质（Extracellular matrix ,ECM）及基底膜（Basal membrane, BM）中硫酸乙酰肝素蛋白多糖（heparan sulfate proteoglycans, HSPG）的内源性糖苷内切酶,在正常组织中除淋巴细胞、骨髓等少有表达外,在正常成熟的非免疫组织中（如心、肺、肝脏、骨骼肌及胰腺等）均不表达,但在几乎所有的转移性恶性肿瘤细胞中普遍存在,抑制肝素酶的表达可以明显抑制肿瘤的增殖及转移。由于Hpa的活化,肿瘤细胞不仅可以突破ECM及BM屏障,而且还可以释放多种因子,促进肿瘤新生血管的生成及肿瘤细胞的局部定殖,Hpa的活化是肿瘤细胞发生转移的一个重要因素。某些肿瘤细胞为逃避免疫监视而下调肿瘤相关抗原的表达,但如果为逃避免疫监视而下调Hpa的表达,其本身就足以抑制肿瘤细胞的增殖及转移。因此,Hpa可以作为一种广谱的肿瘤转移相关抗原用于中晚期肿瘤的免疫治疗。我们既往的研究也发现负载了Hpa全长基因的DC可以诱导肝素酶特异性CTL反应,对Hpa阳性的且HLA匹配的胃癌细胞具有明显的免疫杀伤效应,对于Hpa阳性但HLA不匹配的胃癌细胞则不具有杀伤效应。该结果不仅提示Hpa是肿瘤免疫治疗的一个新的靶点,而且提示其氨基酸全长序列中肯定存在CTL抗原表位,这种表位经DC递呈后可以激活CTL,从而发挥抗肿瘤效应。基于以上分析,本研究拟在国家自然科学基金的资助下,从小鼠肝素酶（mHpa）抗原表位的预测和鉴定开始,系统研究mHpa抗原表位能否在动物体内诱导mHpa特异性的CTL反应,为肝素酶抗原表位的临床应用提供理论依据。方法1.应用表位预测的超基序、量化基序结合人工神经网络方案,在互联网上对小鼠肝素酶H-2K^b限制性CTL表位进行预测;根据预测结果,应用固相合成法正确地合成了高纯度的候选表位肽;使用小鼠TAP缺陷的RMA-S细胞在体外对合成的候选表位肽进行肽与H-2K^b分子的亲和力分析;采用标准⁵¹Cr释放试放实验检测候选表位诱导的CTL对同来源的鼠源性肿瘤细胞的免疫杀伤效应,初步筛选出能诱导mHpa特异性的抗原表位。2.分离培养C57BL/6（H-2K^b）小鼠骨髓来源的树突状细胞（mDC） ,联合rmGM-CSF、rmIL-4及rmTNF-α诱导mDC成熟,利用光镜及电镜技术从形态学上进行鉴定,并结合流式细胞术从细胞表面CD分子进行鉴定;用上述筛选的候选表位负载的mDC疫苗免疫C57BL/6小鼠三次,然后取其脾淋巴细胞作为效应细胞,采用标准51Cr释放试验检测肝素酶特异性CTL对B16黑色素瘤细胞(mHpa⁺, H-2K^b+)、Lewis肺癌细胞(mHpa⁺, H-2K^b+)、EL-4淋巴瘤细胞(mHpa⁺, H-2K^b+)以及P815肥大细胞瘤细胞(mHpa⁺, H-2K^d+)的免疫杀伤效应;采用H-2K^b单克隆抗体封闭上述靶细胞的H-2K^b位点后再用肝素酶表位特异性CTL杀伤上述靶细胞,以研究筛选的肝素酶表位是否受H-2K^b限制;采用标准⁵¹Cr释放试验研究了肝素酶特异性CTL对自体淋巴细胞和mDC的免疫杀伤活性,以研究肝素酶特异性CTL可能产生的毒负作用;采用ELISPOT法检测了肝素酶特异的效应细胞的IFN-γ释放情况。3.为研究上述筛选的表位肽对实验动物的免疫保护效应,先用候选表位负载的mDC疫苗免疫C57BL/6小鼠三次,再将B16黑色素瘤细胞接种到C57BL/6小鼠皮下,一月后处死,观察肿瘤大小的变化;为研究上述筛选的表位肽对实验动物的免疫治疗效应,先将B16黑色素瘤细胞接种到C57BL/6小鼠皮下,一周后待肿瘤长至1mm时,再用候选表位肽负载的mDC疫苗免疫C57BL/6小鼠,一月后处死荷瘤鼠,观察肿瘤大小的变化。结果1.采用生物信息学技术利用互联网上提供的表位预测程序预测出5条肝素酶候选表位肽,即mHpa386-393（VDENFEPL）、mHpa351-358（FAAGFMWL）、mHpa 398- 405 （LSLLFKKL）、mHpa234-241（LGEDFVEL）、mHpa519-526 （FSYGFFVI）;亲和力分析发现预测的5条多肽均能与RMA-S细胞表达的H-2K^b分子有效结合;采用标准51Cr释放实验检测上述肝素酶表位肽负载mDC后诱导的肝素酶特异性CTL对B16黑色素瘤细胞、Lewis肺癌细胞的免疫杀伤效应,结果表明,mHpa398-405、mHpa519-526诱导的CTL对靶细胞具有明显的杀伤效应,而mHpa386-393、mHpa351-358和mHpa234-241诱导的CTL对靶细胞的杀伤效应较弱,提示mHpa398-405、mHpa519-526可以作为小鼠肝素酶候选表位用于下一步的实验研究。2.分离培养C57BL/6（H-2K^b）小鼠骨髓来源的树突状细胞（mDC）,用重组小鼠细胞因子（rmGM-CSF、rmIL-4及rmTNF-α）联合诱导扩增,经形态学及细胞表面CD分子鉴定,成功制备小鼠骨髓来源的成熟DC;用mHpa398-405、mHpa519-526负载骨髓源的mDC,于皮下注射免疫C57BL/6小鼠三次,取其脾淋巴细胞作为效应细胞,采用标准51Cr释放实验检测肝素酶抗原表位特异性CTL对不同的鼠源性肿瘤细胞的免疫杀伤效应,结果表明,肝素酶特异性CTL对肝素酶阳性且H-2K^b阳性的B16黑色素瘤细胞、Lewis肺癌细胞以及EL-4淋巴瘤细胞具有明显的杀伤效应,而对肝素酶阳性但H-2K^b阴性的P815肥大细胞瘤细胞不具有杀伤效应,我们还发现,肝素酶特异性CTL对表达肝素酶的自体淋巴细胞和mDC没有明显的杀伤效应;用H-2K^b封闭靶细胞表面的H-2K^b标记,再用肝素酶特异性CTL对靶细胞进行杀伤研究,结果表明,肝素酶抗原表位特异性CTL对封闭了H-2K^b的靶细胞无明显杀伤效应,提示上述CTL反应是肝素酶特异、且受H-2K^b限制的;采用ELISPORT检测肝素酶特异性效应细胞IFN-γ的分泌能力,结果表明,肝素酶抗原表位能明显促进效应细胞IFN-γ的分泌。3.为在体研究mHpa398-405、mHpa519-526肝素酶表位肽对小鼠的免疫保护及免疫治疗效应,我们先将mHpa398-405、mHpa519-526负载的mDC疫苗分别免疫C57BL/6小鼠,每周一次,共免疫三次后,再将B16黑色素瘤细胞接种到C57BL/6小鼠皮下,一月后处死,观察肿瘤大小的变化,结果表明,mHpa398-405、mHpa519-526免疫保护组小鼠皮下肿瘤体积明显小于阴性肽及未保护组,提示mHpa398-405、mHpa519-526对荷瘤小鼠具有明显的免疫保护效应;进一步我们先将B16黑色素瘤细胞接种到C57BL/6小鼠皮下,一周后待肿瘤长至1mm时,再用mHpa398-405、mHpa519-526肽负载的mDC疫苗分别免疫C57BL/6小鼠,一月后处死荷瘤鼠,观察肿瘤大小的变化,结果表明,mHpa398-405、mHpa519-526免疫治疗组小鼠皮下肿瘤体积明显小于阴性肽及未治疗组,提示mHpa398-405、mHpa519-526对荷瘤小鼠具有明显的免疫治疗效应。结论1.采用生物信息学并结合实验技术首次从小鼠肝素酶全长氨基酸序列中筛选出2条受H-2K^b限制的CTL表位,即mHpa398-405 （LSLLFKKL）和mHpa519-526 （FSYGFFVI）2.动物实验表明mHpa398-405、mHpa519-526可以诱导产生肝素酶特异性CTL,对肝素酶阳性且H-2K^b相匹配的肿瘤细胞具有明显的免疫杀伤活性,对H-2K^b阴性的肿瘤细胞不具有杀伤效应,对封闭了H-2K^b的靶细胞亦无明显杀伤效应,提示小鼠肝素酶抗原表位诱导的CTL反应是肝素酶特异且受H-2K^b限制;小鼠肝素酶特异性CTL对表达肝素酶的自体淋巴细胞和mDC无免疫杀伤活性,提示小鼠肝素酶抗原表位的安全性;小鼠肝素酶抗原表位mHpa398-405、mHpa519-526负载的mDC可以促进效应细胞IFN-γ释放,提示小鼠肝素酶抗原表位可以促进非特异性的抗肿瘤免疫效应。3. mHpa398-405、mHpa519-526对荷瘤小鼠具有明显的免疫保护及治疗作用。以上研究表明,小鼠肝素酶特异性抗原表位mHpa398-405、mHpa519-526不仅能激发机体特异性的抗肿瘤效应,而且还能诱导一个非特异性抗肿瘤的良性循环,这种小鼠肝素酶多肽疫苗具有广谱、高效、特异、安全的优点。本研究从动物在体实验初步证实了肝素酶抗原表位多肽疫苗临床应用的可能性。