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骨折是最常见的因意外损伤而引起的骨科疾病。随着社会迅速发展,严重骨折发生率明显增加。骨修复失败的风险在慢性炎症、糖尿病、维生素缺乏、老年和多发性损伤中升高,治疗时间延长,病人伤残率增加。因此研究促进骨修复的机制、骨折愈合时间的方法显得尤为必要。间充质干细胞参与了骨折愈合过程的几个阶段。骨折损伤部位骨髓间充质干细胞募集在骨修复过程中发挥重要作用,骨折端募集足够数量的骨髓间充质干细胞是骨折愈合的前提条件和细胞学基础。牛膝具有逐瘀通经、补肝肾、强筋骨之功效,中医骨伤科临床上长期用其治疗骨折,本课题组前期研究发现杯苋甾酮通过靶向调控细胞趋化因子受体4促进骨髓间充质干细胞体外迁移。然而,牛膝杯苋甾酮促进干细胞体外迁移的机制,及是否促进干细胞成骨分化和骨折愈合,仍未可知。本文将通过细胞实验和动物实验,揭示杯苋甾酮促进骨折愈合的作用机制。目的:研究牛膝杯苋甾酮促进骨髓间充质干细胞迁移、成骨分化,及骨折愈合的作用机制。方法:1.采用全骨髓灌注法培养SD大鼠原代骨髓间充质干细胞,由于干细胞属于贴壁细胞,因此利用骨髓间充质干细胞贴壁培养法不断去除其他细胞,取生长状态佳、形态正常的P3细胞行骨髓间充质干细胞表面抗原流式细胞术实验检测。2.Cell Counting kit-8(CCK-8试剂盒)检测杯苋甾酮能否促进骨髓间充质干细胞增值。3.细胞体外迁移实验(Transwell)检测杯苋甾酮对骨髓间充质干细胞体外迁移的影响作用。4.细胞免疫荧光实验检测杯苋甾酮对骨髓间充质干细胞肌动蛋白纤维的影响。5.茜素红染色检测杯苋甾酮对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响作用。6.实时荧光定量PCR实验(RT-qPCR)检测杯苋甾酮在骨髓间充质干细胞成骨分化方面相关的mRNA的表达。7.建立SD大鼠单侧股骨干中段骨折模型,使用杯苋甾酮向骨折端局部注射。酶联免疫吸附测定(ELISA法)检测给药不同时期的骨折动物模型血清中SDF-1α的浓度。8.使用生理盐水或杯苋甾酮向实验动物骨折端局部注射,给药六周后提取标本并对骨折部位进行Micro-CT影像学观察。结果:1.流式细胞术细胞鉴定结果:检测细胞表面抗原干细胞阳性标志物结果显示,CD29、CD44、CD73阳性率分别为94.84%、93.71%、93.88%,阳性率均大于90%。表达造血细胞的标志物CD11、CD34、CD45阳性率分别为0.88%、0.88%、0.69%阳性率均小于1%。由流式细胞术结果证实,本实验所使用的细胞均为骨髓间充质干细胞。2.Cell Counting kit-8(CCK-8试剂盒)检测细胞增殖结果:在杯苋甾酮各梯度浓度干预下,与对照组相比,杯苋甾酮各浓度组在不同干预时间(24h、48h、72h)均可促进骨髓间充质干细胞增殖。最佳干预时间为48h,最佳浓度为2.5、5、10μg/mL,且有统计学意义(P<0.0001)。可见,杯苋甾酮可促进骨髓间充质干细胞增殖,且其用于细胞实验的最佳浓度为2.5、5、10μg/mL。本研究采用5、10μg/mL进行后续实验。3.Transwell细胞体外迁移实验结果:在8小时的杯苋甾酮5、10μg/mL浓度干预下,与对照组相比,各组骨髓间充质干细胞呈现不同程度的细胞迁移。其中,10μg/mL浓度杯苋甾酮干预下,骨髓间充质干细胞穿过下室细胞数量显著增多,与空白组比较,差异具有显著的统计学意义(P<0.01)。可见,杯苋甾酮对骨髓间充质干细胞迁移具有积极促进作用。4.细胞免疫荧光实验结果显示:与对照组相比,在杯苋甾酮不同浓度梯度干预下,可不同程度提高骨髓间充质干细胞肌动蛋白纤维收缩,肌丝清晰可见。因此在杯苋甾酮干预下,骨髓间充质干细胞肌动蛋白纤维收缩能力有显著提高。5.杯苋甾酮+骨髓间充质干细胞成骨诱导液干预下,茜素红染色结果:扫描仪及显微镜下观察发现,与单纯成骨诱导组(OIM)比较,杯苋甾酮+成骨诱导组对矿化结节的形成具有显著促进作用。可见,杯苋甾酮促进骨髓间充质干细胞成骨分化。此外实时荧光定量PCR的结果显示,与成骨诱导组(OIM)比较,杯苋甾酮+成骨诱导组ALP、0PN的mRNA较升高,差异有统计学意义(P<0.05),且BMP-2的mRNA显著升高,差异有统计学意义(P<0.01)。6.SD大鼠骨折模型动物实验,给药一周后杯苋甾酮低剂量及高剂量治疗组的大鼠血清中SDF-1a含量开始升高,而模型组大鼠血清中SDF-1a含量呈下降趋势。给药两周后牛膝杯苋甾酮低剂量组及高剂量组的大鼠血清中SDF-1a含量均显著高于模型组(P<0.01)。7.Micro-CT重建结果显示杯苋甾酮低浓度组及高浓度组的骨折部位接近愈合,而模型组(PBS组)骨折部位仍有较大骨折线。总骨体积分数统计图、新生骨体积分数统计图、原始固有骨体积分数统计图分析结果显示:杯苋甾酮低剂量组及高剂量组的新生骨骨体积分数均高于模型组,其中低剂量治疗组升高最为显著(P＜0.01)。结论:杯苋甾酮具有促进体外骨髓间充质干细胞增殖、迁移及成骨分化的作用;同时,杯苋甾酮促进骨折模型大鼠的损伤修复。因此,中药牛膝的有效提取物——杯苋甾酮可作为促进骨折修复的一种新型药物,为中医药加快骨折愈合开辟新的治疗思路,为新药开发奠定基础。