酶分子的表面修饰技术是指利用蛋白质工程技术对酶分子表面的某些氨基酸残基进行置换;或在酶分子表面的特定位置偶联某些化学基团。通过对酶分子表面进行修饰,提高酶分子在特定溶剂中的稳定性或催化活性;调控酶分子在特定溶剂中的聚集行为;提高酶分子固定化效果等。表面修饰技术已越来越广泛地应用于酶分子的改造中。本论文以具有多功能催化活性（Promiscuous activity）的Mycobacterium smegmatis酰基转移酶（Acyl transferase,缩写为MsAcTase）为研究对象,利用定点突变技术,首先在MsAcTase分子表面不同位置引入突变氨基酸残基;然后借助突变氨基酸残基,对突变后的MsAcTase进行糖基化修饰。为实现这一目的,体内糖基化修饰和体外糖基化修饰两条技术路线,将被尝试。MsAcTase突变体编码基因分别导入毕赤酵母和大肠杆菌中异源表达。选择毕赤酵母表达外源突变基因,以期利用毕赤酵母本身的糖基化修饰系统,对重组蛋白进行胞内糖基化修饰;而选择大肠杆菌表达外源突变基因,重组蛋白将进行体外糖基化修饰。具体实验结果如下:1、利用YASARA软件,结合已解析的MsAcTase八聚体结构,在MsAcTase分子的表面,筛选合适的突变位点。拟进行体内糖基化修饰的突变基因,筛选并构建具有Asn-Xaa-Ser/Thr序列的突变体;拟进行体外糖基化修饰的突变基因,在MsAcTase分子表面的合适位点引入-Cys突变。经过分析,最终筛选出MsAcTase-Q¹⁵⁹N,MsAcTase-I¹⁸⁶N,MsAcTase-D²⁰³S三个候选突变体作为体内糖基化修饰的突变体;筛选出MsAcTase-C⁷S/C⁷⁷S/A¹⁴³C和MsAcTase-C⁷S/C⁷⁷S/S¹⁸⁴C,作为体外糖基化修饰的候选突变体。2、评估上述突变体的突变效应。将上述突变基因分别导入到大肠杆菌中,诱导表达,并分离纯化后,测定突变体重组蛋白的基本酶学性质,评估突变效应。实验结果表明:MsAcTase-I¹⁸⁶N的比活力降低为野生型MsAcTase的74%,而突变体MsAcTase-D²⁰³S和突变体MsAcTase-Q¹⁵⁹N的酶比活并没有显著变化;以乙酸乙酯为底物测定MsAcTase、MsAcTase-Q¹⁵⁹N和MsAcTase-D²⁰³S的k_cat/K_m分别为:219.9L·mmol^-1·min^-1,147.3 L·mmol^-1·min^-1,163.0L·mmol^-1·min^-1。MsAcTase-C⁷S/C⁷⁷S/A¹⁴³C和MsAcTase-C⁷S/C⁷⁷S/S¹⁸⁴C的比活力与野生型MsAcTase相比均降低,突变体MsAcTase-C⁷S/C⁷⁷S/A¹⁴³C比活力降低为野生型MsAcTase的70%,突变体MsAcTase-C⁷S/C⁷⁷S/S¹⁸⁴C的比活力降低为野生型MsAcTase的55%。以乙酸乙酯为底物测定的MsAcTase、MsAcTase-C⁷S/C⁷⁷S/A¹⁴³C、MsAcTase-C⁷S/C⁷⁷S/S¹⁸⁴C的k_cat/K_m分别为:219.9 L·mmol^-1·min^-1,144.6 L·mmol^-1·min^-1,124.3 L·mmol^-1·min^-1。显著性分析表明:除突变体MsAcTase-I¹⁸⁶N、MsAcTase-C⁷S/C⁷⁷S/A¹⁴³C和MsAcTase-C⁷S/C⁷⁷S/S¹⁸⁴C外,MsAcTase-Q¹⁵⁹N和MsAcTase-D²⁰³S均无显著性差异。3、将野生型过水解酶MsAcTase及其突变体MsAcTase-Q¹⁵⁹N和MsAcTase-D²⁰³S的编码基因导入到毕赤酵母中表达,分离纯化后测定的重组蛋白比活力分别为:MsAcTase、MsAcTase-Q¹⁵⁹N和MsAcTase-D²⁰³S的比活力分别是47.6 U/mg,56.4U/mg和47.9 U/mg。以乙酸乙酯为底物,MsAcTase、MsAcTase-Q¹⁵⁹N和MsAcTase-D²⁰³S的k_cat/K_m分别为:47.0 L·mmol^-1·min^-1,65.6 L·mmol^-1·min^-1,61.5L·mmol^-1·min^-1。PAS染色和Endo H糖苷酶处理重组MsAcTase和突变体重组蛋白,实验结果均表明:实验结果均未发现两个突变体被糖基化修饰。