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目的：以显性失活突变体基因导入技术为研究手段，侧重研究了P13K、Akt、p70对细胞周期的影响；P13K、Akt、p70、MAPKs)及AP-1等信号转导分子之间的上、下游关系；以及上述信号分子是否参与周期调节蛋白(cyclin D1，E2F和Rb)的表达改变，从信号转导水平分析B(a)P致细胞周期改变的分子生物学机制。
方法：
1、将一系列基因(显性失活突变体基因、AP-1荧光素酶报告基因)分别或共转染人胚肺成纤维细胞(human embryo lung fibroblasts，HELF)：AP-1荧光素酶报告基因单独或与DN-p38、DN-Akt分别共转染HELF的细胞模型已由本室构建成功。本文继续构建AP-1荧光素酶报告基因分别和DN-JNK、DN-ERK、DN-△-P85稳定共转染HELF的细胞模型，以G418选择性筛选细胞系，用荧光素酶报告基因和免疫印记(Western blot，WB)技术鉴定。
2、采用流式细胞术(FCM)检测B(a)P刺激的HELF及基因导入的细胞系中细胞周期的变化。采用MTT试验检测B(a)P对HELF细胞增殖的影响。
3、用荧光素酶报告基因技术检测AP-1活性，用WB方法测定HELF中cyclin D1、E2F-1、Rb、MAPKs、Akt、p70等蛋白的表达及磷酸化水平，用免疫荧光法观察p70、MAPKs表达水平及核浆定位。
4、运用AP-1化学抑制剂姜黄素(Curcumin)和p70化学抑制剂雷帕霉素(Rapamycin)、MAPKs显性失活突变体(DN-ERK、DN-JNK和DN-p38)、P13K及Akt的显性失活突变体(DN-△-P85和DN-Akt)导入技术证明通路的上下游关系。
结果：
1、成功建立了AP-1荧光素酶报告基因分别和DN-JNK、DN-ERK、DN-△-P85稳定共转染HELF的细胞模型。
2、B(a)P对HELF细胞周期分布和细胞增殖的影响2μmol/L B(a)P处理组细胞增殖达峰值，且S期细胞比例(50.2％±4.6％)与对照组(16.7％±8.1％)相比明显增加，G1期细胞比例明显降低(P<0.01)；提示细胞由G1期进展到S期。ERK和JNK显性失活突变体的过表达均明显降低B(a)P处理组S期细胞比例(分别降低到33.3％±1.7％，30.8％±3.9％) (P<0.05)；而p38显性失活突变体的过表达对B(a)P引起的S期细胞比例的增加没有影响。AP-1化学抑制剂姜黄素(20μmol/L)预处理细胞1h后，继续用2μmol/L B(a)P刺激细胞24 h可明显降低B(a)P引起的S期细胞比例增加(降低到13.6％±2.9％，P<0.05)。DN-△-P85和DN-Akt的过表达均明显降低B(a)P处理组s期细胞比例(分别降低到28.1％±1.2％，31.2％±3.2％)(P<0.05)。不同浓度雷帕霉素0、10、20 nmol/L预处理细胞1h后，继续用2μmol/LB(a)P处理HELF-AP-1 24 h，发现雷帕霉素呈剂量依赖性地抑制B(a)P诱导的AP-1活性增强；雷帕霉素10 nmol/L可明显抑制B(a)P引起的S期细胞比例增加。提示DN-ERK、DN-JNK、DN-△-P85、DN-Akt、雷帕霉素、姜黄素均可抑制B(a)P诱导的HELF细胞周期改变，而DN-p38对B(a)P诱导的细胞周期改变无影响。
3、B(a)P诱导的信号蛋白的活化HELF暴露于B(a)P后，细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)、p38和(c-Jun)氨基末端激酶(JNK)、Akt和p70的磷酸化水平均表达增加；AP-1活性增强，磷酸化Rb(p-Rb)水平、cyclin D1和E2F-1表达也增高。
4、B(a)P诱导MAPKs家族成员和p70活化后核定位情况：对照组中磷酸化的ERK、JNK、p38和p70在胞浆和胞核中均有表达，主要集中在胞浆，而2μmol/L B(a)P处理细胞1-2h后，磷酸化的p70、ERK、JNK和p38明显向胞核转移。
5、MAPKs与AP-1、细胞周期调节蛋白之间的关系DN-ERK和DN-JNK过表达均可明显降低B(a)P诱导的AP-1活性增强；而DN-p38过表达对B(a)P引起的AP-1活性增强无影响；DN-ERK和DN-JNK的过表达均能明显降低B(a)P诱导的cyclin D1、E2F-1及p-Rb表达增强，阻断p38活性也可明显降低B(a)P诱导的p-Rb蛋白表达增强，而阻断p38活性不影响B(a)P诱导的cyclin D1及E2F-1蛋白表达增强。
6、P13K、Akt、p70、AP-1及细胞周期调节蛋白之间的相互关系DN-△P85可显著抑制B(a)P引起的Akt和p70磷酸化水平增加，并可抑制B(a)P诱导的AP-1转录活化，证明P13K是Akt和p70的上游激酶；DN-Akt也可显著抑制B(a)P诱导的p70磷酸化水平表达增加；雷帕霉素对B(a)P诱导的p70磷酸化及AP-1转录活化均具有剂量依赖性的抑制作用，而对B(a)P诱导的Akt磷酸化无明显影响。这些结果表明：P13K-Akt/p70信号通路参与B(a)P诱导的AP-1活化。阻断P13K活性可显著降低B(a)P诱导的cyclin D1和E2F-1蛋白的表达增加，并抑制B(a)P引起的p-Rb水平增强；阻断Akt活性也可显著降低B(a)P诱导的cyclin D1蛋白的表达增加，并抑制B(a)P引起的p-Rb水平增强；雷帕霉素也有相同的抑制作用，并且呈剂量依赖性关系。
结论：
1、ERK和JNK通过活化AP-1及细胞周期调节蛋白(cyclin D1、E2F-1及p-Rb)介导B(a)P诱导的细胞周期改变；而p38未参与B(a)P诱导的AP-1活性增强及细胞周期改变；
2、P13K-Akt/p70信号通路参与了B(a)P诱导的AP-1活化和细胞周期改变；P13K-Akt/p70信号通路通过细胞周期调节蛋白(cyclin D1、E2F-1及p-Rb)参与B(a)P诱导的细胞周期改变。
综上所述，P13K-Akt/p70/MAPKs/AP-1信号通路通过细胞周期调节蛋白参与B(a)P诱导的细胞周期改变。本研究以MAPK信号通路为基础向上延伸至P13K-Akt/p70，向下延伸至AP-1及细胞周期调节蛋白，阐明了P13K-Akt/p70/MAPKs/AP-1信号通路在B(a)P诱导细胞周期改变中的分子机制，所得结果不仅加深了对B(a)P致病的分子机制的理解，也将有助于B(a)P危害的防治。