帕金森病(Parkinson’s Disease，PD)是中老年人常见的中枢神经系统慢性退行性疾病，是中老年人致残的主要原因之一。其发生机制是由于中脑黑质纹状体多巴胺(Dopamine，DA)能神经元的退行性变性，以及由此导致纹状体递质系统功能紊乱所致。其临床症状主要表现为静止性震颤、动作迟缓、运动减少、肌强直和姿势平衡障碍等而导致生活不能自理。PD的发病率及致残率很高，不仅给患者带来痛苦，也加重了社会和家庭的负担。目前对本病的临床治疗均属症状性治疗，不能阻多巴胺能神经元的进行性丢失，无法改变PD进行性发展的趋势。在胚胎干细胞移植治疗方面，因移植材料来源匮乏及移植细胞存活率低而受限制，基因治疗也面临着载体继发的安全性及毒性等问题。因此，寻找确切有效，易于临床应用的保护多巴胺能神经元的治疗措施，根本上预防PD的发生和阻止疾病的进展，已成为当前研究的热点。脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)属神经营养素(neurotrophin)家族的成员，能够促进多种神经元的存活，尤其对多巴胺能神经元有很强的营养和保护作用。BDNF能促进多巴胺能神经元的存活、分化与生长，能特异性的保护多巴胺能神经元抵抗神经毒性物质的破坏作用，并参与PD的发病与病理进程，被认为是治疗PD的新一代药物，但因为BDNF为大分子物质，不能透过血脑屏障，脑室内用药又极其不方便，给临床的应用带来很大困难。TAT是HIV-1的反式激活蛋白，能够高效、快速的穿透磷脂双分子层的生物膜，不仅能跨膜转导进入细胞内部，而且还能够将与其共价结合的异源蛋白转导到组织及细胞内，甚至透过血脑屏障进入中枢神经系统。国外已有学者将TAT与相对分子质量为(15～200)×10~3的蛋白进行融合后，介导这些蛋白从细胞外到细胞内的直接跨膜转运。还有报道提到TAT与铜锌超氧化物歧化酶的融合蛋白跨膜进入胰岛β细胞可以达到治疗Ⅰ型糖尿病的目的。将TAT与P53和P27等肿瘤抑制蛋白输入含有腹膜肿瘤的小鼠模型，可以延长小鼠的寿命。TAT的转导作用具有速度快，不依赖于温度、能量、细胞膜抗体，而且对细胞没有损伤等特点，因此被认为是一种很有前途的运载工具。目前有关TAT融合蛋白的神经系统应用多集中在对脑缺血疾病的研究中，对于TAT融合脑源性神经营养因子治疗帕金森病的研究，国内外尚未见报道。本课题首先利用增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)作为标记蛋白，构建TAT-EGFP重组载体并表达融和蛋白，静脉注射小鼠后观察融和蛋白进入体内各组织的情况，以证实TAT的蛋白转导能力，尤其是穿透血脑屏障进入脑组织的能力，为TAT携带药物治疗中枢神经系统疾病提供理论基础。随后构建TAT—BDNF重组载体并表达融和蛋白，经过在体外与多巴胺能神经元作用检测其生物学活性后，静脉注入PD大鼠模型，来观察TAT—BDNF对模型鼠的治疗作用，以期找到一种能静脉应用且能够穿透血脑屏障有效治疗PD的方法。本研究分为以下三个部分：第一部分TAT介导EGFP在小鼠体内的跨膜转运方法：1．以pEGFP-N3为模版，通过PCR及基因克隆技术，构建表达载体pEGFP。2．人工合成编码TAT蛋白转导域的两条DNA片段，退火后得到双链。双链经过酶切及与pEGFP连接后，构建表达载体pTAT—EGFP。利用双酶切及基因测序来鉴定载体。3．将重组载体转至大肠杆菌E．coli BL21(DE3)中，在IPTG的诱导下，优化表达条件，表达出融合蛋白TAT—EGFP。SDS—PAGE凝胶电泳检测蛋白的分子量。同时表达对照蛋白EGFP。4．融和蛋白经过Ni离子亲和层析柱纯化。5．将得到的纯化后的融合蛋白经尾静脉注入小鼠的体内，4h后取脑、心肌、肝、脾、肾等器官作冰冻切片，荧光显微镜下观察融合蛋白在组织中的分布。以尾静脉注射EGFP蛋白作为对照组。结果1．琼脂糖凝胶电泳检测pEGFP-N3的PCR产物为720bp，符合预期的大小。2．重组质粒pEGFP与pTAT—EGFP双酶切后得到的共同产物为720bp的EGFP与5000bp的pET28a质粒，片段符合预期的大小。经过基因测序，与Genbank上对照，序列达到100％，表明EGFP基因正确的插入到载体上，成功得到重组质粒pTAT—EGFP及pEGFP。3．在IPTG的诱导下，发现0.5mmol／L IPTG、30℃诱导3h时融合蛋白TAT—EGFP以可溶性表达最高，0.5mmol／L IPTG、30℃诱导4h时蛋白EGFP以可溶性表达最高。SDS—PAGE检测发现TAT—EGFP分子量约为28KD，EGFP的分子量约为27KD，符合预期的大小。4．经过Ni离子亲和层析柱纯化后，得到纯度大于85％的蛋白。5．小鼠尾静脉注射融合蛋白TAT—EGFP及对照EGFP蛋白，4h后TAT—EGFP组在脑、肝、肾、脾、心、骨骼肌等各个器官组织中均检测到绿色的荧光，其中以肝、脾、肾中最多，心肌、脑其次，骨骼肌中亦有分布，对照组小鼠组织切片未检测到荧光。第二部分pTAT—BDNF载体构建、表达及TAT—BDNF对多巴胺能神经元的营养作用方法：1．提取人脑组织RNA，设计合成引物，RT—PCR的方法克隆人BDNF基因。2．将酶切的BDNF基因与原核表达载体pTAT／HA相连接，构建重组表达载体pTAT／HA—BDNF。双酶切及基因测序鉴定重组质粒。3．将质粒转至大肠杆菌E．coli BL21(DE3)中，在IPTG的诱导下，优化表达条件，表达出融合蛋白TAT—BDNF。SDS—PAGE凝胶电泳检测蛋白的分子量。4．包涵体蛋白经过洗涤、变性溶解后过Ni离子亲和层析柱纯化。5．Western-blot进一步检测融合蛋白TAT—BDNF的完整性。6．取14d孕鼠，分离培养胎鼠的中脑神经元细胞，用TH及MAP2免疫荧光细胞化学染色鉴定多巴胺能神经元细胞。7．原代培养多巴胺能神经元细胞，1w换2次液，观察细胞的生长状况。8．原代培养至第6d，分成5组，第1、2组暂不加干预因素，第3、4、5组加入不同浓度的TAT—BDNF，至第10d，除第一组外，均加入100μmol／L的6～0HDA，继续培养24h后，通过MTT检测细胞的活力，来观察TAT—BDNF对多巴胺能神经元的保护作用。9．各组细胞在加入6—OHDA 24h后，Hoechst33258／PI双重荧光染色检测细胞凋亡，观察TAT—BDNF对多巴胺能神经元的保护作用。结果：1．常规提取出人脑RNA，用巢式PCR的方法得到约763bp的人BDNE基因，与预期相符。2．质粒pTAT／HA—BDNF用EcoRⅠ和XhoⅠ酶切鉴定，切出与BDNF的PCR产物大小相当的片段，以及与载体pTAT／HA(3.0kb)大小一致的片段，表明人BDNF基因已正确插入载体pTAT／HA。pTAT／HA—BDNF重组质粒测序结果与Gnebank登录的基因序列相比，序列完全相符，表明成功得到重组载体pTAT／HA—BDNF。3．重组pTAT／HA—BDNF转化BL21(DE3)菌后，经IPTG诱导后产生一条约35KD的特异蛋白条带，与预期的蛋白质分子量大小相符。诱导条件优化后发现，在IPTG为0.5mmol，37℃，4h的条件下诱导的目标蛋白总蛋白比值最高。4．蛋白几乎都是以包涵体的形式存在于沉淀中，包涵体经过洗涤，变性溶解后，经过镍离子亲和层析柱纯化得到较为纯净的蛋白。5．Western—blot检测TAT—BDNF同时具有BDNF的免疫原性及多聚组氨酸的免疫原性，说明表达的融合蛋白完整。6．TH及MAP2免疫荧光细胞化学染色鉴定多巴胺能神经元细胞，发现多巴胺能神经元细胞占80％以上，完全能达到实验的需要。7．原代培养的不同天数观察细胞，可见到细胞贴壁，长出神经突起并延长交织呈网状。8．四唑盐(MTT)比色法测定细胞生长指数，5、20、50μg／L TAT—BDNF预处理组多巴胺能神经元细胞活力较6—OHDA组比均有显著提高(P＜0.01)，而与正常对照组比较无明显差异，其中50、20μg／L TAT—BDNF较5μg／L TAT—BDNF细胞活力更高(P＜0.05)。9．Hoechst33258／PI双重荧光染色可以看到，正常培养的多巴胺能神经元仅有少量的细胞凋亡，经6—OHDA作用后可见大量的细胞凋亡，经过TAT—BDNF预处理的细胞凋亡的情况较6—OHDA作用组明显减少，而50μg／ml、20μg／ml实验组较5μg／ml实验组效果明显。第三部分融和蛋白TAT—BDNF对PD大鼠的治疗作用方法：1．用6—OHDA与立体定向仪，制作PD大鼠纹状体二点单侧毁损模型。2．检测TAT—BDNF在脑内的分布：大鼠随即分为2组：实验组及对照组，每组3只，共6只。实验组在制作模型当时，尾静脉注射0.1ml(500μg)的TAT—BDNF，转导对照组尾静脉注射0.1ml的生理盐水，4h后取中脑组织，用HA免疫荧光组织化学染色来检测TAT—BDNF是否进入脑组织内。3．提取实验组及对照组大鼠中脑组织，Western—blot检测TAT—BDNF在脑组织内的分布。4．TAT—BDNF对PD大鼠的治疗作用：大鼠随即分为4组：正常组，模型组，实验组及对照组，每组16只，共64只。实验组在制作模型当时，尾静脉注射0.1ml(500μg)的TAT—BDNF，以后每7d注射一次，至28d。对照组尾静脉注射0.1ml的生理盐水，每7d注射一次，至28d。各组在不同的时间点作行为学检测，记录并比较阿扑吗啡诱发的旋转圈数。5．第28d时，TH免疫组织荧光检测各组大鼠黑质中多巴胺能神经元，计算细胞核轮廓清晰的TH免疫阳性神经元，比较各组之间的差异。6．第28d时，TUNEL法检测大鼠中脑黑质凋亡神经元，计算每张冠状切片的TUNEL阳性细胞数，比较各组之间的差异。结果：1．采用荧光免疫组织化学染色后在荧光显微镜下观察，静脉注射TAT—BDNF蛋白4h后PD大鼠的中脑内能看到均匀分布的由HA标记的融合蛋白，而对照组在荧光显微镜下不能看到荧光标记的TAT—BDNF，证实TAT能介导BDNF穿过血脑屏障进入中枢神经系统。2．Western—blot分析结果显示在注射TAT—BDNF融合蛋白4h后的大鼠中脑的蛋白提取液中能检测到具有多聚组氨酸抗原特性的蛋白质。而从转导对照组大鼠中脑提取的蛋白质则不能与多聚组氨酸抗体起反应。说明融合蛋白已穿过血脑屏障分布到中枢神经组织内。3．模型组和对照组大鼠旋转行为最为明显，实验组转速有所下降，旋转的幅度也减轻，表现为旋转的圆周扩大，而正常组无明确的旋转行为。在实验组治疗的前14d统计结果显示实验组和对照组之间没有差异，第21d时两组有显著性差异，第28d时两组比较有极显著差异。4．正常组大鼠黑质内TH阳性神经元主要分布于黑质网状部，沿黑质区长轴方向排列，数量较多，胞体较大，呈锥体形或椭圆形，纤维细长，量多而密集神经元突起较明显。模型组TH阳性神经元明显减少，分布稀疏，神经元胞体轮廓及突起不清晰。TAT—BDNF实验组TH阳性神经元及阳性纤维较对照组明显改善，神经元及纤维数量明显增多。5．TUNEL法显示模型组及对照组大鼠损毁侧中脑黑质区有大量染色阳性细胞，细胞核固缩，呈棕黄色，并可见裂解的棕色凋亡小体。通过计算机图像分析系统统计平均每张冠状切片的凋亡细胞数。结果显示损伤后注射TAT—BDNF蛋白的大鼠平均每张中脑黑质切片的TUNEL阳性细胞数明显小于对照组，正常组未见阳性细胞。说明6—OHDA注入纹状体后可逆向引发同侧黑质DA能神经元以凋亡形式发生退化，TAT—BDNF可能通过抗凋亡的作用保护大鼠多巴胺能神经元。结论1．小鼠尾静脉注射融合蛋白TAT—EGFP 4h后，在肝、脑、肾、脾、心肌及骨骼肌等组织内均有绿色荧光的分布，而注射了EGFP的对照组组织中未见荧光，提示了TAT能够携带EGFP穿透生物膜屏障进入各个组织，甚至是穿透血脑屏障进入中枢神经系统，为TAT携带大分子蛋白物质治疗中枢神经系统疾病提供了理论基础。2．首次将表达的融和蛋白TAT—BDNF与多巴胺能神经元作用后，证实TAT—BDNF能保护细胞抵抗6—OHDA的神经毒性，细胞存活率明显提高。提示合成的TAT—BDNF具有与BDNF相同的神经保护的生物学活性。3．采用纹状体二点单侧毁损术成功制备了PD大鼠模型，从大鼠旋转行为的变化可看出6—OHDA的对黑质内DA能神经元的毁损是渐进性的，比黑质毁损法制备的模型能更好地模拟PD的发病过程。提示该模型能更好地显示在PD早期DA能神经元进行性变性阶段药物的治疗作用。4．首次将融和蛋白TAT—BDNF用于PD大鼠模型的治疗，实验组大鼠较对照组在行为学上有很大的改善，TH阳性神经元增多，TUNEL染色显示凋亡细胞减少。提示TAT能携带BDNF穿透血脑屏障进入中枢神经系统起到治疗作用，给临床外源大分子物质治疗PD提供了一条新思路。