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糖尿病神经病理性疼痛（Painful diabetic neuropathy,PDN）是一种特殊类型的神经病理性痛,是糖尿病最常见的、顽固并发症,给病人带来折磨、严重影响病人生活质量。目前临床治疗效果极差。最近趋化因子CXCL13及其受体CXCR5被证明在由外周组织炎症或神经损伤诱导的慢性疼痛中起关键作用。然而,在糖尿病神经痛中CXCL13及CXCR5是否参与进而如何参与糖尿病性神经痛仍不明确。在本研究中,我们研究了CXCL13/CXCR5是否介导PDN和可能的相关分子机制。本研究以自发性Ⅱ型糖尿病db/db小鼠模型和链脲佐菌素（STZ）诱导Ⅰ型小鼠糖尿病神经痛模型为实验对象。db/db小鼠显示出明显的高血糖和肥胖,长时程机械痛敏增加,在脊髓中CXCL13、CXCR5以及促炎细胞因子TNF-α和IL-6的表达增加。链脲佐菌素（STZ）诱导Ⅰ型小鼠表现出高血糖和消瘦,早期出现机械痛敏,晚期更出现热痛和机械痛痛敏都增加,在脊髓中CXCL13、CXCR5以及促炎细胞因子TNF-α,IL-1β和IL-6的表达也显著增加。此外,在两种模型小鼠的脊髓中,存在神经胶质显著增加和磷酸化的细胞信号激酶（包括pERK,pAKT和pSTAT3）的表达上调。机械痛敏,上调的pERK、pAKT和pSTAT3以及TNF-α和IL-6的产生都可以被MK-801（非竞争性NMDA受体拮抗剂）明显抑制。U0126（选择性MEK抑制剂）或AG490（JAK/STAT抑制剂）,可以明显抑制db/db小鼠机械痛敏,和脊髓pERK（通过U0126）或pSTAT3（通过AG490）的上调。C57BL/6J小鼠,被鞘内注射CXCL13后表现明显的热痛觉过敏和机械痛敏,pERK、pAKT和pSTAT3上调以及促炎细胞因子（IL-1β、TNF-α和IL-6的产生）表达增加,而这些结果均可以因Cxcr5基因敲除而减弱。我们的研究表明,脊髓中趋化因子CXCL13及其受体CXCR5在PDN的发生发展中起重要作用,针对CXCL13/CXCR5的分子标靶而开发的新型治疗方法可能有助于PDN的临床治疗。研究目的:PDN严重影响糖尿病病人的生活质量,但其发病分子机制仍然未明,治疗手段有限。本实验自发性Ⅱ型糖尿病db/db小鼠模型和链脲佐菌素（STZ）诱导Ⅰ型小鼠糖尿病周围神经痛为模型,意图研究糖尿病患者伴发的PDN的发生机制,为治疗PDN寻求新的方向。研究方法:1.将小鼠分成WT组和db/db组,在不同时间点（从4周开始）测定空腹血糖、体重和机械痛痛阈值随时间的变化。在出生后第七周,取材脊髓腰膨大部分,采用RT-PCR进行趋化因子的筛选。2.小鼠被分成WT组和db/db组,检测小鼠脊髓中星形胶质细胞和小胶质细胞以及小鼠脊髓中Cxcl13,Cxcr5表达和促炎细胞因子水平变化。3.给db/db小鼠鞘内注射MK-801（NMDA受体拮抗剂）、U0126（选择性MEK抑制剂）或AG490（JAK/STAT抑制剂）,测机械痛变化,取脊髓腰膨大部分匀浆后离心,上清用于Western blot分析pERK、pAKT和pSTAT3。4.给Cxcr5–/–小鼠及其C57对照小鼠,鞘内注射CXCL13。取脊髓腰膨大部分匀浆后离心,上清用于Western blot分析pERK,pAKT和pSTAT3。5.雄性C57BL/6小鼠腹膜内施用60mg/kg剂量的链脲佐菌素（STZ）,诱导Ⅰ型糖尿病模型。测STZ诱导的糖尿病小鼠机械疼痛,取脊髓腰膨大部分做RT-PCR,做趋化因子的筛选。6.将小鼠分成C57组和C57+STZ组,取脊髓部分匀浆后离心,上清用于Western blot分析CXCR5,CXCL13,以及磷酸化蛋白表达和细胞因子水平的测定。研究结果:1.db/dbⅡ型糖尿病小鼠,其显示出明显的高血糖和肥胖,长期机械痛痛敏增加,以及脊髓中趋化因子Cxcl13和Cxcr5 mRNA表达增加。2.在db/db小鼠的脊髓中,存在显着增加的神经胶质增生。在db/db小鼠的血清中促炎细胞因子TNF-α和IL-6的水平增加。3.在db/db小鼠上,机械性异常性疼痛和上调的pERK,pAKT和pSTAT3以及TNF-α和IL-6的产生都被非竞争性NMDA受体拮抗剂MK-801减弱。如果给db/db小鼠脊髓给予U0126（选择性MEK抑制剂）或AG490（Janus激酶（JAK）STAT抑制剂）,它们都可以减少机械性异常性疼痛,但仅抑制pERK（通过U0126）或pSTAT3（通过AG490）。4.CXCL13诱导C57小鼠产生显著的超过6小时的机械痛觉过敏,而在Cxcr5–/–小鼠上无效。注射后1小时,CXCL13显著增加C57对照小鼠脊髓中TNF-α,IL-6和IL-1βmRNA水平,但在Cxcr5–/–小鼠没有变化。鞘内注射CXCL13可以增强C57小鼠血清中的TNF-α,IL-6和IL-1β水平,但在Cxcr5–/–小鼠无效。最后,鞘内注射后脊髓中的磷酸化ERK（pERK）,AKT（pAKT）和STAT3（pSTAT3）的表达。CXCL13在C57小鼠的脊髓中诱导快速pERK,pAKT和pSTAT3上调,这一效应在Cxcr5–/–小鼠中缺失。5.STZ诱导的Ⅰ型糖尿病小鼠上,其显示出明显的高血糖和消瘦,长期机械异常性疼痛,以及脊髓中趋化因子Cxcl13和Cxcr5 mRNA表达增加。6.在STZ诱导的Ⅰ型糖尿病小鼠的脊髓中,存在显着增加的神经胶质增生和上调细胞信号激酶的磷酸化,包括pERK,pAKT和pSTAT3。7.糖尿病的自身免疫和炎症病理过程,导致脊髓CXCL13与其膜受体CXCR5表达的增加。CXCL13与CXCR5的结合后激活ERK,STAT3和AKT细胞内信号传导途径。磷酸化的ERK,STAT3和AKT导致促炎细胞因子如TNF-α,IL-6和IL-1β的表达释放增加,调节涉及神经炎症的各种细胞事件,而促进疼痛的发生和发展。研究结论:在本研究中,我们提供的证据表明,脊髓中趋化因子CXCL13及其受体CXCR5有助于PDN的发病机制。我们证明CXCL13/CXCR5信号传导是驱动pERK,pAKT和pSTAT3细胞信号传导途径并促进TNF-α和IL-6产生的重要上游介质。因此,针对CXCL13/CXCR5的治疗可为PDN的患者提供机会。研究亮点:1.我们的工作第一次明确提出CXCL13/CXCR5和糖尿病PDN的发生发展有关。2.我们的工作明确阐明在脊髓水平,CXCL13/CXCR5如何通过pERK,pAKT和pSTAT3以及TNF-α和IL-6的产生的细胞和分子信号机理。3.在糖尿病小鼠针对CXCL13/CXCR5、细胞分子信号激酶、炎症因子的不同水平的干预措施和效果的尝试,为下一步的临床试验研究提供了一些有价值的资料。