【摘 要】
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Nescient Helix Loop Helix 2(N hlh2)基因编码神经特异性碱性螺旋-环-螺旋(Basic Helix Loop Helix 2,b HLH)转录因子,主要在胚胎时期和成年神经内分泌组织中表达,参与胚胎
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Nescient Helix Loop Helix 2(N hlh2)基因编码神经特异性碱性螺旋-环-螺旋(Basic Helix Loop Helix 2,b HLH)转录因子,主要在胚胎时期和成年神经内分泌组织中表达,参与胚胎时期神经系统形成发育和成年时期垂体功能的维持。研究表明,Nhlh2基因敲除(Nhlh2-knockout,N2KO)会影响下丘脑-垂体轴功能,导致小鼠初情期启动障碍,伴随着性器官发育不良和生育力下降。雌性N2KO小鼠卵巢和子宫在幼年阶段正常发育,而在初情期启动前时期可观察到卵泡在窦状阶段停止发育,表明Nhlh2基因可能影响初情期启动前卵泡的发育成熟。本实验以初情期前(165d)、初情期(200d)和初情期后(215d)长大二元母猪作为实验对象,通过实时荧光定量PCR分析母猪初情期前、初情期、初情期后三个时期的卵巢组织Nhlh2基因表达量;通过PCR扩增获得Nhlh2基因5’调控区序列,构建含有5’调控区序列缺失片段的双荧光素酶报告基因重组体,转染母猪卵巢颗粒细胞,分析启动子活性并确定启动子区核心调控区域。生物信息学网站预测分析Nhlh2基因启动子核心调控区域潜在转录因子结合位点,通过染色质免疫共沉淀(ChIP)验证核转录因子与Nhlh2基因启动子区结合位点的结合互作情况。构建转录因子超表达载体和干扰RNA,转染猪卵巢颗粒细胞,通过qRT-PCR和Western Blot实验技术,在基因转录水平上分析转录因子对N hlh2基因表达调控的影响。主要研究结果如下:(1)克隆获得Nhlh2基因5’调控区-3565/+129区域的全长3694 bp启动子序列,成功构建Nhlh2基因启动子序列系列缺失片段报告基因重组体;重组载体转染猪卵巢颗粒细胞,双荧光结果表明-238/-30区域启动子转录活性最高,存在起正向调控作用的转录因子结合位点,为启动子核心调控区域。(2)生物信息学网站分析预测结果表明Nhlh2基因启动子核心调控区域-101/-85和-153/-140分别存在转录因子YY1和C/EBPβ的结合位点。ChIP实验结果表明转录因子YY1和C/EBPβ在Nhlh2基因启动子-101/-85和-153/-140区域存在结合互作情况。(3)荧光定量PCR检测结果表明,相比于初情期和初情期后两个时期的卵巢组织,母猪初情期前时期Nhlh2基因mRNA表达量最高;转录因子YY1 mRNA表达量在初情期前时期表达量最高;转录因子C/EBPβmRNA表达量在初情期启动时期表达量最高。(4)构建转录因子YY1和C/EBPβ表达载体,转染至猪卵巢颗粒细胞,结果表明YY1抑制Nhlh2基因启动子转录活性和抑制Nhlh2基因转录;干扰YY1表达,增强Nhlh2基因启动子转录活性和促进Nhlh2基因转录,表明转录因子YY1抑制Nhlh2基因转录。C/EBPβ抑制Nhlh2基因启动子转录活性和抑制Nhlh2基因转录;干扰C/EBPβ表达,增强Nhlh2基因启动子转录活性和促进Nhlh2基因转录,表明转录因子C/EBPβ抑制Nhlh2基因转录。
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