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第一部分RNase E抑制因子RraA的结构和功能研究RNase E(ribonuclease E,核糖核酸酶E)是广泛地存在于植物和细菌细胞中,是参与众多功能RNA成熟和mRNA降解代谢过程中的限速酶。以RNase E为组装支架,PNPase(核苷酸磷酸化酶)三聚体、RhlB(RNA酶解螺旋酶B)单体以及enolase(烯醇化酶)二聚体的相互作用结合共同组成mRNA降解体功能复合物,共同协调完成对mRNA的降解过程。RraA是至今为止发现的对RNase E起抑制作用的调控因子,已有的研究证实RraA可与降解体复合物其它几种组分PNPase、RhlB和enolase在RNase E的C端非催化区域结合位点的竞争结合,并降低该几种组分在RNA降解体复合物中含量达到其抑制作用。蛋白质的结构特征决定其功能的行使。为了进一步了解RraA对降解体功能复合物在mRNA降解处理过程中的作用,我们选取临床上常见的机会致病菌-绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)为研究对象;克隆、表达、纯化并利用气相扩散法结晶获得了绿脓杆菌RraA(PaRraA)晶体,使用in house X射线光源收集了一套分辨率为2.0?的衍射数据;以大肠杆菌(E.coli)RraA(PDB code 1q5x)为结构搭建模型,利用分子置换法(Molecular Replacement,MR)获得了PaRraA晶体三维空间结构模型(Rfactor =20.8%,Rfree=24.2%,PDB code 3C8O)。通过结构分析发现:PaRraA与已知的其它物种来源的RraA分子结构相似,为结构保守的蛋白质。利用激光光散射实验和凝胶层析实验本研究首次证实:PaRraA在溶液中为六聚体形式,符合晶体中的“两个三聚体形成的二聚体”这一分子堆积方式;通过蛋白质结构和序列分析发现:PaRraA六聚体分子含有的六个带电荷区域,提示其可能参与该分子同降解体其它组分-PNPase、RhlB和enolase在RNase E的C端非催化区域的竞争结合,从而调节降解体的降解活性,这为进一步理解该分子对体内RNA降解机制提供了理论依据。第二部分细菌鞭毛hook组装蛋白FlgD的结构和功能研究鞭毛是致病菌重要的毒力因子,参与细菌与宿主的相互作用。细菌的鞭毛是由超过50个基因编码的蛋白质进行组装和调控。鞭毛主要由基体(basal body)、鞭毛钩(hook)和鞭毛丝(filament)三个部分组成。其中,鞭毛沟(hook)象铰链一样联系鞭毛(filament)和细胞膜上的鞭毛基体(basal body),由hook蛋白质FlgE组装而成。FlgD是鞭毛hook组装过程中重要的支架分子(scaffolding protein);在未成熟的鞭毛hook组装过程中,FlgD形成的临时“帽子”结构亦可以阻挡hook蛋白FlgE的分泌泄露;另外,FlgD与FliK能共同调控FlgE聚合方式,使hook的长度在一定范围内。已有的研究证实:FlgD仅存在于大肠杆菌和沙门氏菌鞭毛hook的组装期,是鞭毛hook结构组装过程中的调控蛋白。迄今为止,关于FlgD蛋白分子的结构信息非常局限,仅有植物致病菌Xanthomonas campestris来源的FlgD分子结构得以解析,但仅有C端约130个氨基酸区域晶体结构信息(XcFlgD; PDB code 3c12)。尚未获得参与hook组装过程中起重要作用的N端结构信息。为了进一步了解该分子在鞭毛组装、调控等过程中的生物学作用,我们以临床常见的机会致病菌-绿脓杆菌为研究对象,通过flgd的克隆、表达、纯化、结晶,并对FlgD晶体进行X射线晶体衍射获得了母体衍射数据;利用在上海同步辐射收集的Se-Met多波长反常散射数据,应用XPREP寻找Se重原子的坐标,利用Solve解析相位和Resolve进行相位优化和模型搭建,然后运用Coot和Refmac进行结构修正,完成了PaFlgD分辨率为2.4?的三维结构的解析(PDB code 3IOA)。实验获得了C端131个氨基酸蛋白质分子空间结构,与降解实验获得的14.5kDa的片段相吻合。获得的PaFlgD分子结构为两个较独立的结构域:Tudor结构域和Fn-Ⅲ结构域杂交组合而形成的结构,其中β折叠(β-strand)含量非常丰富,相关的结构和功能关系研究正在进行中。