随着在粮、经、饲和工业领域的广泛应用,玉米已成为我国目前种植面积最大和产量最高的禾谷类作物。怎样提高玉米产量已经成为保障粮食安全的重中之重,而选育耐密优良品种将会是解决我国这些问题的有效途径。耐密优良品种的选育是解决我国耕地面积减少与玉米供需矛盾的有效途径。叶夹角作为耐密品种的重要外在形态指标,直接决定了玉米在高密度种植条件下对避荫综合症的抵抗能力,对于改善群体冠层结构,增强光能的利用率,减小避荫综合症的诱发因素,提高光合产物在源、流、库之间的高效合理运转,增强光合产物的积累和产量的提高具有重要的作用。对控制叶夹角相关基因的克隆和分子机理的解析,是开展耐密高产玉米品种选育的基础。但是通过图位克隆的方法对调控玉米叶夹角的QTLs进行候选基因的分离并未见报道,其调控机理的研究更未被阐明。本试验利用紧凑型自交系豫82与松散型自交系D132构建的F2作图群体,对调控玉米叶夹角的主效QTL q LA4-1采用回交方法构建近等基因系。以BC3F2、BC3F3和BC4F2分离群体为材料对q LA4-1进行了精细定位并图位克隆该区域内的候选基因,通过关联分析、遗传转化等方法对该区域内的候选基因进行功能分析,明确候选基因的时空表达规律,初步探讨了Zm CLA4在调控玉米叶夹角过程中的分子作用机制。主要研究结论如下:1、利用玉米自交系豫82和D132构建的F2:3家系为初级定位群体,采用复合区间作图法对叶夹角进行初级定位。其中,在三个环境下同时检测到控制叶夹角的一个主效QTL q LA4-1,其位于第4染色体4.03区域,介于标记umc1821与umc1317之间,可以解释表型变异的36.8%,表现加性基因作用方式。在此基础上,以叶片平展的玉米自交系D132为轮回亲本经过多次回交、自交的方法构建该位点的近等基因系。结合新开发的42对多态性SSR标记,利用侧翼分子标记分析法最终将q LA4-1区间限定在标记SSR4-26和SSR4-28之间,将目标区段距离由3.6c M缩小到48kb,释放出一个1个BAC(AC197327)。2、通过生物信息学和序列差异性分析结果表明,与水稻控制分蘖/叶夹角的基因LAZY1具有同源性的基因是q LA4-1区域的候选基因,命名为Zm CLA4。该基因编码一个包含412个氨基酸的蛋白质,推测该蛋白包含一个TMD(氨基端)和一个NLS(羧基端)。通过对Zm CLA4基因c DNA序列的分析表明,在D132-NIL和D132之间存在两个SNPs位点和两个片段插入/缺失突变。其中,两个SNPs中碱基突变(C/G,T/C)分别导致甘氨酸(自起始氨基酸后第25个氨基酸)突变为丙氨酸,精氨酸(自起始氨基酸后第202个氨基酸)突变为半胱氨酸;第4外显子中2个碱基的缺失引起氨基酸移码突变和翻译提前终止,促使继缺失位点之后的90个氨基酸均呈现多态性,且与D132相比,导致D132-NIL中减少了8个氨基酸。关联分析结果表明,两个多态性位点C/T/mutation607和CA/indel965与叶夹角之间存在显著关联(P=10-7)。亚细胞定位结果证明了先前所推测的Zm CLA4氨基酸序列的C-端、包含TMD和NLS结构域具有功能性,Zm CLA4蛋白贯穿于细胞质膜和细胞核之间起运输作用。3、荧光定量PCR分析结果表明Zm CLA4基因在D132和D132-NIL的m RNA的积累量具有一定的相似性,均是在茎尖、叶枕、叶鞘、叶片中m RNA积累较多,在根中虽有积累但表达积累量较低,各器官m RNA的积累量均从4叶期开始,8到11叶期较高,11叶期后降低。结合玉米自交系D132和D132-NIL中不同生育期叶夹角的变化情况来看,Zm CLA4基因m RNA的累积与叶夹角的变化存在一个严格的依赖发展过程和负相关性,表明Zm CLA4通过改变m RNA的积累负向调控叶夹角的发育。4、通过遗传转化技术将所构建的Zm CLA4 RNAi和Zm CLA4过表达载体分别转入玉米自交系豫836和水稻品种Kitaake中,通过对T2代转基因植株和野生型对照材料的叶夹角表型比较分析表明,玉米Zm CLA4 RNAi转基因家系穗上叶夹角平均值明显大于野生型对照,与之相反,Zm CLA4过表达水稻转基因T2代植株的上三叶叶夹角的平均值小于其野生对照型的叶夹角平均值,结果进一步印证了Zm CLA4涉及玉米叶夹角的调控。以转基因株系和近等基因系为材料,利用细胞学观察分析结果表明,D132与D132-NIL、RNAi转基因植株与野生型对照植株在其所选取部位的横截面细胞的形状和数目存在显著的差异。表明Zm CLA4可能影响细胞分裂和发育从而导致叶夹角的变化。通过胚芽鞘的向地性反应试验,结果表明D132和Zm CLA4 RNAi转基因材料与之相对应的D132-NIL和野生型植株相比,其向地性反应明显减弱,进一步证实Zm CLA4调控玉米的向地性从而导致叶片夹角的改变。由此推测,Zm CLA4基因m RNA积累量的差异影响了生长素的极性运输,由此改变了生长素在茎尖中的分布,从而导致向地性和细胞发育的变化,最终影响叶夹角的变化。