研究背景和目的卵巢癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一,其晚期患者五年存活率仅25%-30%。近年来,卵巢癌在我国的发病率呈上升趋势,且趋向于年轻化。随着肿瘤遗传学和分子生物学技术的发展,对卵巢癌的发病机理进行了广泛而深入的研究,认识到遗传物质的异常是肿瘤形成的主要原因。肿瘤的发病是以癌基因的激活及抑癌基因的失活为细胞癌变的分子基础。在同种类型的肿瘤中存在相同的细胞遗传异常,表明这些异常是肿瘤发生的一个主要原因。卵巢癌的发生、发展涉及多个异常基因,因此,寻找与卵巢癌发生发展相关的靶基因,进行针对性的基因治疗是目前肿瘤研究的迫切任务。近年来应用比较基因组杂交技术（comparative genomic hybridization,CGH）发现卵巢癌普遍存在着染色体结构异常,其中20号染色体出现基因扩增的几率较高,尤以20q13.2位点为频,该位点有STK15和ZNF217（zinc finger protein,217）两个基因。ZNF217基因位于人染色体20q13.2,是新近克隆出的肿瘤候选基因之一,它编码的Krupple样转录因子属于锌指蛋白家族。研究表明锌指蛋白家族成员在多种肿瘤的发生、发展过程中发挥重要作用。ZNF217基因作为转录调控因子有可能参与肿瘤的发生与发展过程。Kate G.R.Quinlan等认为ZNF217利用PXDLS基序（位于C端结合蛋白底物结合域的结合沟里）和RRT基序（主要结合于C端结合蛋白的核苷酸结合域表面的沟）与C端结合蛋白相作用,而产生转录抑制。ZNF217拷贝数扩增,基因高表达,抑制肿瘤抑制基因启动子的表达,导致肿瘤发生。文献报道ZNF217在肿瘤发生中的主要作用是降低某些肿瘤抑制因子的表达水平,提高癌基因的表达水平,其在不同细胞内的表达差异与p53 a和pRB的状态有关.。研究发现多种启动因子与ZNF217和C端结合蛋白2结合,当去除ZNF217基因后,这些启动因子被激活。在食管鳞癌、肺癌、胃癌、前列腺癌、结直肠癌研究中,发现ZNF217基因参与癌的发生、发展过程。目前,ZNF217基因在乳腺癌的研究已经较为成熟,认为是乳腺癌发生的两个促进因子之一。Tanner等人检测到卵巢癌患者ZNF217基因拷贝数发生扩增,表达增强,但仅局限于对该基因的结构改变方面的研究,目前未见其功能研究的相关文献报道。本研究重点探讨ZNF217基因在卵巢癌发生、发展过程中的作用,为阐明卵巢癌的发生机制提供理论依据。方法1.FISH检测ZNF217基因在卵巢癌组织及细胞株中的扩增情况利用FISH分别检测不同分期的卵巢浆液性囊腺癌、囊腺瘤及正常卵巢组织中ZNF217基因及HO-8910、SKOV₃及OVCa-R₃三种卵巢浆液性囊腺癌细胞株中ZNF217基因的扩增情况。2.RT-PCR检测卵巢癌组织及细胞株中ZNF217基因的表达利用RT-PCR检测ZNF217基因在卵巢癌组织及细胞株中的表达,筛选高表达的细胞株,用于后续的RNAi干扰实验。3.RNAi效果鉴定设计ZNF217基因干扰片段,构建重组质粒载体pGenesil/ZNF217shRNA,利用阳离子脂质体Lipofectaine ^TM2000将pGenesil/ZNF217shRNA导入卵巢上皮性癌细胞株HO-8910中,用空质粒载体做阴性对照,经G-418筛选获得抗性单克隆,挑取荧光强的克隆进行扩大培养,荧光定量RT—PCR和Western blot鉴定干扰后ZNF217基因在细胞中的表达;利用MTT法、平板克隆形成率、侵袭运动实验检测ZNF217基因表达沉默对细胞体外增殖、侵袭及运动能力的影响。4.体内观察ZNF217基因表达沉默对卵巢癌细胞增殖的影响利用MTT法检测和分析干扰后对卵巢癌细胞体内增殖能力的影响。5.利用基因芯片技术分析ZNF217基因在卵巢癌发生机制中的细胞信号转导作用利用Affymetrix公司的寡核苷酸芯片检测ZNF217基因表达沉默前后差异基因表达谱。用Gene Ontology、MILANO、Panther、Genomatix、GenCLIP等软件进行生物信息学分析,绘制ZNF217基因在卵巢癌发生发展中的信号通路图。利用荧光定量PCR方法对所获得的差异基因进行鉴定。6.统计学分析应用SPSS 13.0软件进行数据分析,FISH和RT-PCR采用两独立样本x²检验和R×C表资料x²检验;运动实验、侵袭实验、克隆形成率实验采用两独立样本t检验的方法,体外增殖实验和皮下成瘤实验采用重复测量的方差分析。结果1.FISH检测ZNF217基因在卵巢癌组织及人卵巢癌细胞株中扩增情况在11例Ⅰ期的卵巢浆液性囊腺癌红色荧光信号超过2个有3例,Ⅲ-Ⅳ期（12例）的有9例,卵巢浆液性囊腺瘤（10例）基本上为2个红色荧光信号,有1例出现3个红色荧光信号,12例正常卵巢组织全为2个荧光信号。在癌组织中,该基因扩增占12例（52.17%）,其中分化晚期的卵巢癌9例（75.00%）,早期卵巢癌3例（25%）,晚期卵巢癌与早期有显著性差异（x²=5.239,p=0.039）。良性肿瘤只有1例发生扩增,可能为偶发事件,而正常的卵巢组织未发现有ZNF217基因扩增,癌组织与囊腺瘤、正常上皮组织有显著性差异（x²=12.682,p=0.002）。HO-8910、SKOV₃及OVCa-R₃三种卵巢浆液性囊腺癌细胞株中ZNF217基因均发生扩增。2.RT-PCR检测卵巢癌组织及细胞株中ZNF217基因的表达ZNF217基因在人卵巢癌细胞株HO-8910中高表达。卵巢癌与卵巢良性肿瘤、正常卵巢组织比较,ZNF217mRNA表达有显著性差异（x²=13.705,p=0.001）。13例ZNF217高表达的卵巢癌组织中,Ⅰ期卵巢癌占3例（3/13=23.07%）,Ⅲ-Ⅳ期有10例（10/13=76.03%）,晚期卵巢癌与早期亦有显著性差异（x²=6.418,p=0.027）。说明ZNF217基因在卵巢癌组织细胞中的表达高于良性肿瘤及正常卵巢组织,晚期ZNF217基因的表达显著高于早期。RT-PCR检测结果显示ZNF217基因在人卵巢癌细胞株HO-8910中高表达,可以用于后续的RNAi实验。3.沉默ZNF217基因在卵巢癌细胞HO-8910中的表达干扰效果鉴定:采用pGenesil质粒载体系统,构建了针对靶基因ZNF217的2个RNAi载体pGenesil/ZNF2171shRNA和pGenesil/ZNF2172shRNA。经测序结果证实后,将pGenesil/ZNF2171shRNA和pGenesil/ZNF2172shRNA分别干扰HO-8910细胞,将干扰率较高的pGenesil/ZNF217lshRNA干扰片段用于后续实验。含干扰片段和阴性对照的HO-8910细胞经G-418筛选获得抗性单克隆。荧光定量RT-PCR和Western Blot结果发现ZNF217基因在clone2中表达显著降低（命名为HO-8910/ZNF217^-）,干扰率达86%。4.ZNF217基因表达沉默后对卵巢癌细胞生物学特性的影响MTT法观察ZNF217基因表达沉默后体外细胞的增殖情况,与HO-8910/HK和HO-8910相比,HO-8910/ZNF217^-增殖减慢,三组差异非常显著（F=19.115,p=0.000）。平板克隆形成实验结果也显示HO-8910/ZNF217^-细胞的单个细胞的增殖能力较其它组显著减低,统计学差异显著（t=4.354,p=0.012）。这些结果均说明ZNF217基因表达水平减低后,肿瘤细胞体外生长被显著抑制。体外侵袭小室检测ZNF217基因表达沉默后细胞侵袭能力的改变,结果显示,HO-8910/ZNF217^-细胞的侵袭能力低于与HO-8910/HK细胞的侵袭能力,差异非常显著（t=6.613;p=0.000）,说明ZNF217表达沉默显著抑制了卵巢癌细胞的体外侵袭能力。运动小室检测ZNF217基因表达沉默后细胞运动能力的改变,结果显示HO-8910/ZNF217^-细胞的运动能力低于与HO-8910/HK细胞的运动能力,差异非常显著（t=13.013;p=0.000）,说明ZNF217表达沉默抑制了卵巢癌细胞的体外运动能力。通过卵巢癌皮下成瘤实验观察ZNF217基因表达沉默后对卵巢癌增殖能力的影响。将HO-8910/HK、HO-8910/ZNF217^-细胞接种于裸鼠的皮下,通过21d连续的观察,发现ZNF217基因表达沉默后,显著性的抑制了卵巢癌细胞的体内增殖能力,增殖差异从第15d开始,到21d,差异达到3倍。5.利用基因芯片技术探讨ZNF217在卵巢癌增殖、侵袭、运动中的作用利用Aflymetrix公司制备的Human Genome U₁33plus2原位合成寡核苷酸芯片对HO-8910/ZNF217^-和HO-8910/HK细胞的基因表达谱进行分析,对获得的下调基因进行信号通路及聚类分析,发现3个主要的信号网络簇,ZNF217基因处于核心位置,ZNF217基因沉默后94个与肿瘤的凋亡、侵袭及转移有关的基因表达下调达8-64倍。其中MMP-24基因下调32倍,该基因在正常组织及肿瘤组织均有表达,经常在不同的肿瘤中检测到该基因发生扩增,但在卵巢癌中未见相关文献报道。结合ZNF217基因沉默后与下调基因介导的卵巢癌信号通路图分析,推测MMP-24基因可能是参与卵巢癌发生机制的新基因,具体机制需要进一步研究证实。结论1.ZNF217基因是卵巢癌的增殖、侵袭、运动的促进基因,ZNF217基因有望成为卵巢癌基因治疗的靶点:2.与ZNF217基因具有协同作用的基因中MMP-24与ZNF217基因关系密切,可能是卵巢癌发生机制中的新基因。