【摘 要】
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目的:肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma;HCC）是原发性肝癌（Primary liver cancer;PLC）最常见的组织学类型,预后较差。尿激酶型纤溶酶原激活物受体（Urokinase plasminogen activator receptor;uPAR）在多种恶性肿瘤中高表达,并在肿瘤发生发展过程中起重要作用。本课题组前期研究表明,uPAR在肝癌组织中表达升高,但
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目的:肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma;HCC）是原发性肝癌（Primary liver cancer;PLC）最常见的组织学类型,预后较差。尿激酶型纤溶酶原激活物受体（Urokinase plasminogen activator receptor;uPAR）在多种恶性肿瘤中高表达,并在肿瘤发生发展过程中起重要作用。本课题组前期研究表明,uPAR在肝癌组织中表达升高,但其在HCC中的作用机制尚未完全明确。本实验将进一步验证过表达uPAR基因对肝癌细胞生物学功能的影响,并探讨uPAR与整合素之间潜在的分子机制。方法:首先,本实验利用细胞转染技术,用载有过表达uPAR基因的慢病毒载体转染肝癌HepG2细胞,再利用嘌呤霉素筛选出稳转株进行扩增培养,设立为uPAR过表达组（LV-uPAR）。与此同时,采用阴性对照病毒转染的细胞作为空载对照组（Control）,未经转染处理的细胞作为未转染组（Untreated）。实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR;RT-PCR）和免疫印迹实验（Western blot;WB）分别用于检测转染后各实验组uPAR的mRNA和蛋白水平的表达,确认uPAR过表达是否成功。其次,系列功能学实验将用于验证过表达uPAR对肝癌HepG2细胞功能的影响。其中,CCK8实验用于检测细胞的增殖能力;Transwell迁移和划痕实验用于检测细胞的迁移能力;Transwell侵袭实验用于检测细胞的侵袭能力;克隆形成实验用于检测细胞的克隆形成能力;流式细胞术用于检测过表达uPAR基因对HepG2细胞周期和凋亡的影响。最后,为探讨uPAR和整合素β1是否存在相互作用,RT-PCR和WB实验用于检测过表达uPAR后HepG2细胞中整合素β1的变化,并用WB检测粘着斑激酶（Focal adhesion kinase;FAK）的表达水平。SPSS22.0软件用于数据统计,组间比较采用单因素方差分析进行。结果:稳定过表达uPAR的肝癌HepG2细胞株构建成功。慢病毒转染组细胞均发出GFP荧光且生长状态良好,转染效率达80%以上;RT-PCR和WB结果显示,与未转染组和空载对照组相比,过表达组uPAR mRNA和蛋白表达水平均明显升高,差异具有统计学意义（P<0.01）。CCK8结果表明,uPAR过表达组细胞增殖能力在48h开始明显高于其他两组（P<0.01）;细胞划痕实验中,12h至24h时间段里,uPAR过表达组伤口愈合率小于未转染组和空载对照组（P<0.05）;Transwell迁移实验发现,未转染组、空载对照组和uPAR过表达组的迁移细胞数分别为（180.20±6.56）、（192.67±9.29）和（327.52±3.61）个,差异具有统计学意义（P<0.01）;Transwell侵袭实验中,uPAR过表达组穿过Matrigel胶的个数是（316.00±8.00）,明显多于未转染组（259.28±4.58）和空载对照组（271.33±5.03）（P<0.01）;克隆形成实验中,未转染组、空载对照组和过表达组细胞形成的克隆个数分别为（225.33±11.06）、（240.33±5.86）和（409.33±12.90）（P<0.01）;流式细胞术结果提示,与其他两组相比,过表达组G0/G1所占比例较低（P0.05）。最后,RT-PCR和WB结果显示,uPAR过表达组整合素β1 mRAN和蛋白表达水平明显高于两个对照组（P<0.01）;此外,FAK蛋白表达水平也明显升高,差异有统计学意义（P<0.01）。结论:通过慢病毒转染可成功构建稳定过表达uPAR的HepG2细胞株。过表达uPAR可促进肝癌细胞的增殖,迁移和侵袭能力,促使HepG2细胞从G0/G1期进入S期,但对细胞凋亡结局没有明显影响。此外,过表达uPAR导致整合素β1水平升高,其作用机制可能与整合素β1-FAK信号传导途径相关。
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