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N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)是一种非人源性唾液酸,普遍存在于除人类以外的许多哺乳动物中,如马、狗的血清和大猩猩等动物体内。但人类食用富含Neu5Gc的食物如红肉等,体内富集产生异种自身抗原,进而刺激机体引起炎症,加快肿瘤和相关疾病的发生。因此,若在宰前,特别是侯宰环节找到合适的预处理方式来降低红肉中含量,将会对红肉供应生产链的安全性生产产生深远影响。因此,本文拟从动物宰前处理筛选有效降低Neu5Gc合成的酶抑制剂,并对其作用效果以及机制进行研究。(1)Neu5Gc合成关键酶抑制剂的体外筛选通过文献查阅,确定木犀草素、山奈酚、槲皮素作为实验试剂,进行大鼠原代颌下腺上皮细胞(RAT-iCELL-g009)、前列腺癌细胞(PC3)内吞抑制实验结果表明:木犀草素、山奈酚、槲皮素能抑制游离态Neu5Gc通过细胞胞饮或内吞作用进入细胞。与对照组相比,实验组大鼠原代颌下腺上皮细胞(RAT-iCELL-g009)中Neu5Gc含量分别减少35.77±2.75%、37.59±2.52%、29.77±2.9%;实验组前列腺癌细胞(PC3)中Neu5Gc含量分别降低34.98±2.74%、42.25±1.45%、42.21±0.66%。(2)抑制大白鼠体内Neu5Gc合成的研究在前期实验的基础上,探究大鼠活体中Neu5Gc合成的干预效果,分别选用木犀草素150mg/(kg·d)、山奈酚200 mg/(kg·d)、槲皮素200 mg/(kg·d)的浓度剂量对大鼠进行为期60 d的经口灌胃实验,之后对灌胃30 d、60 d的大鼠肌肉组织、肝脏、肾脏中的Neu5Gc进行高效液相色谱检测,结果表明:30 d时,与对照组比较,木犀草素、山奈酚、槲皮素对肌肉组织中Neu5Gc的合成抑制效果显著,最大抑制率为13.36±0.09%(P<0.05);对肾脏、肝脏中Neu5Gc合成的抑制作用不显著。60 d时,与对照组相比,木犀草素、山奈酚、槲皮素对肌肉组织中Neu5Gc的合成抑制效果减弱,对肾脏、肝脏中Neu5Gc含量的抑制作用增强,最大抑制率为:34.35±0.09%(P<0.05);故经抑制率计算及日常膳食综合评价,确定最佳灌胃时间为30 d。(3)大鼠体内Neu5Gc合成与抑制剂浓度的关系通过确定最佳灌胃时间,在前期筛选的浓度上下各增加两个浓度梯度进行为期30 d的灌胃实验,结果表明:与对照组比较,木犀草素对抑制大鼠肌肉组织、肝脏中Neu5Gc合成的最佳作用浓度为150 mg/(kg·d),抑制率分别为:13.48±1.83%、12.8±0.06%,对大鼠肾脏中Neu5Gc的合成会随着浓度的逐渐升高而增强;不同浓度的山奈酚对大鼠体内Neu5Gc的合成均有一定的抑制作用,且对肌肉组织中Neu5Gc的抑制存在量效关系;槲皮素对抑制大鼠肌肉组织、肝脏及肾脏中Neu5Gc合成的最佳浓度为200 mg/(kg·d),抑制率分别为:24.74±0.07%、14.79±0.09%、5.82±0.02%。(4)抑制Neu5Gc合成的唾液酸转移酶机制的分子模拟探究采用分子对接和分子动力学模拟方法探究相关抑制机制。分子对接二维相互作用图表明,木犀草素、山奈酚和槲皮素都有效占据了唾液酸转移酶特异性抑制剂5’胞苷单磷酸的活性位点。对复合物进行200 ns的动力学模拟表明唾液酸转移酶和木犀草素产生氢键作用的残基主要是:Glu305、Asn150,和山奈酚产生氢键作用的残基主要是His301和Gly298,和槲皮素产生氢键作用的残基主要是Gly293、Glu324、Thr272、Ser276。结合自由能分解表明范德华力、静电相互作用、氢键对抑制过程具有重要作用。