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心脏是脓毒症时最易损靶器官之一,经常表现为心肌细胞变性坏死、心肌收缩功能和舒张功能受损。脓毒症患者约有50%可发生心脏功能障碍,其死亡率高达70%～90%。脓毒症心肌功能障碍（sepsis-induced myocardial dysfunction,SIMD）,也称为脓毒症心肌抑制、脓毒性心肌病（Septic cardiomyopathy）,是脓毒症休克难以纠正,导致死亡的重要原因。目前,关于SIMD的发病机制主要包括:心肌抑制物;心肌能量代谢障碍;氧自由基;细胞凋亡;基因调控等许多因素共同作用引起心肌结构和功能异常。自噬（autophagy）是一种细胞维持内环境稳态的生物学机制,它通过降解并再循环利用细胞质中的长寿命蛋白以及衰老、废弃的细胞器等来为细胞的存活提供能量。自噬可由应激如缺血再灌注损伤、压力负荷等触发。自噬具有双重作用,适度的自噬促进细胞的存活,但过度自噬又可以导致细胞死亡,可见自噬是一把“双刃剑”。miR-214通过靶向调控PTEN在心肌细胞凋亡、氧化损伤、心肌纤维化、心室压力负荷等方面发挥重要调节作用,但miR-214对于维持细胞内环境稳态及自噬调节过程尚属未知,有必要进行深入研究。PTEN/Akt/mTOR信号通路被广泛报道是细胞凋亡和自噬激活的经典信号通路。我们假设miR-214可以调控PTEN/Akt/mTOR通路,抑制心肌细胞自噬,减轻脓毒症小鼠心脏功能障。我们从心功能、心脏形态学、心肌蛋白表达等方面观察miR-214对SIMD小鼠心脏功能的影响,探讨其作用机制,为SIMD的治疗提供新思路。本研究共分四部分。第一部分脓毒症患者的心功能及血浆中miR-214的表达水平目的:探讨脓毒症患者的心功能及血浆中miR-214的表达水平。方法:1.选择沧州市中心医院EICU自2018年10月至2021年02月收治的125例脓毒症患者作为研究对象,根据病情严重程度,分为脓毒症组（50例）和脓毒症休克组（75例）。根据床旁心脏超声检测的EF值结果,分为脓毒症无心肌抑制组（83例）和脓毒症心肌抑制组（42例）。选择健康体检者10例作为对照组。2.收集脓毒症患者入EICU时的基本资料,床旁超声检测患者入EICU时的心功能参数,及对症积极治疗后再行超声监测心功能参数。3.采用RT-qPCR方法检测患者入EICU时血液中miR-214的表达情况。4.使用Spearman相关分析检测血浆miR-214表达水平、超声下心功能参数、心肌酶学指标、脏器功能指标、APACHEⅡ评分、SOFA评分等之间的相关性。结果:1.在125例脓毒症患者中,42例出现心肌抑制,脓毒症心肌抑制的发病率为33.60%;2.与脓毒症无心肌抑制组患者相比,脓毒症心肌抑制患者血清中miR-214表达水平有所升高,差异有统计学意义（P<0.05）;3.脓毒症心肌抑制患者血浆中miR-214表达与EF、c TNI、SOFA评分呈正相关。小结:1.脓毒症心肌抑制组患者血浆中miR-214的表达明显升高。2.脓毒症心肌抑制患者血浆中miR-214表达与c TNI、SOFA评分呈正相关,与EF值呈负相关。第二部分脓毒症小鼠心肌自噬活性和miR-214表达变化目的:观察脓毒症小鼠心肌自噬活性和miR-214表达变化。方法:1.实验选取6-8周龄（18-22g）昆明小鼠,采用盲肠结扎穿孔术（cecal ligation puncture,CLP）复制脓毒症心肌损伤模型。将小鼠随机分为4组:对照组（假手术组）、脓毒症6h组、脓毒症12h组、脓毒症24h组,每组10只。2.采用全自动生化分析仪检测心肌损伤标记物:肌酸激酶同工酶（creatine kinase-MB,CK-MB）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）的水平。3.采用酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测血清肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha,TNF-α）、白细胞介素-1（Interleukin-10,IL-10）、心肌肌钙蛋白-I（Myocardial troponin I,cTnI）的水平。4.采用实时定量聚合酶链反应（Real-time polymerase chain reaction,RT-qPCR）检测心肌miR-214的表达水平。5.采用免疫荧光法检测心肌LC3B的水平,采用免疫组化法检测心肌p62的水平,Western blot法检测心肌LC3-II/I、p62的水平,评估心肌自噬情况。6.CLP术后6h,采用小动物超声仪检测小鼠心功能（LVEF及LVFS）。7.采用HE染色观察小鼠心肌组织形态学变化。采用透射电子显微镜观察小鼠心肌细胞自噬情况。结果:1.与对照组相比,脓毒症组小鼠血清CK-MB、LDH的水平及TNF-α、IL-10的水平随时间延长逐渐升高。CLP术后6h,心脏超声显示LVEF及LVFS明显降低,小鼠出现心功能障碍。CLP术后24h心肌组织HE染色出现明显的病理损伤;2.与对照组相比,脓毒症组小鼠在CLP术后6h时miR-214的表达水平明显升高,但随着时间延长则逐渐降低;3.与对照组相比,脓毒症组小鼠在CLP术后24h,心肌组织LC3B的水平明显升高,p62的水平明显降低,透色电镜下心肌细胞内出现自噬小体。小结:1.CLP术后24h,小鼠出现血清炎症因子升高、心肌酶学标记物升高、心功能障碍以及心肌组织病理改变,CLP术能够成功模拟脓毒症心肌损伤模型。2.脓毒症时小鼠心肌组织出现明显的自噬。3.脓毒症时小鼠心肌组织miR-214的表达出现先升高,后逐渐降低的动态变化。第三部分miR-214对脓毒症小鼠心肌自噬以及心功能的影响目的:观察miR-214在脓毒症小鼠心肌自噬中的作用。方法:1.实验选取6-8周龄（18-22g）昆明小鼠,采用盲肠结扎穿孔术（cecal ligation puncture,CLP）复制脓毒症心肌损伤模型。将小鼠随机分为6组:对照组、脓毒症组、miR-214过表达空白对照组、miR-214过表达组、miR-214抑制空白对照组、miR-214抑制组,每组10只。2.CLP术前3天,通过小鼠尾静脉注射腺病毒调控miR-214的表达。于CLP术后24h杀鼠,留取心脏及血清标本。3.采用全自动生化分析仪检测心肌损伤标记物:CK-MB和LDH的水平。4.采用ELISA法检测血清TNF-α、IL-10、cTnI的水平。5.采用实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测心肌miR-214的表达水平。6.采用免疫荧光法检测心肌LC3B的水平,采用免疫组化法检测心肌p62的水平,Western blot法检测心肌LC3-II/I、p62的水平,评估心肌自噬情况。7.CLP术后6h,采用小动物超声仪检测小鼠心功能（LVEF及LVFS）。8.采用HE染色观察小鼠心肌组织形态学变化。采用透射电子显微镜观察小鼠心肌细胞自噬情况。结果:1.与对照组相比,脓毒症组小鼠在CLP术后24h时心肌组织miR-214的表达水平升高了1.52倍。与脓毒症组相比,miRNA-214过表达组小鼠心肌组织miR-214的表达水平升高了3.64倍,miR-214抑制组小鼠心肌组织miR-214的表达水平降低了79.8%。miR-214过表达空白对照组及miR-214抑制空白对照组心肌组织miR-214的表达,与脓毒症组相比差异无统计学意义;2.与脓毒症组相比,过表达miR-214能显著降低脓毒症小鼠血清CK-MB、LDH的水平及TNF-α、IL-10的水平,减轻心肌组织自噬水平,改善心功能,减轻心肌组织的病理损伤;3.与脓毒症组相比,抑制miR-214能显著升高脓毒症小鼠血清CK-MB、LDH的水平及TNF-α、IL-10的水平,提高心肌组织自噬水平,使心功能恶化,加重心肌组织的病理损伤。小结:1.上调miR-214的表达,能抑制脓毒症小鼠心肌自噬,改善心功能。减轻心肌病理损伤。2.下调miR-214的表达,能促进脓毒症小鼠心肌自噬,加重心功能恶化,加重心肌病理损伤。第四部分miR-214通过调控PTEN/Akt/mTOR信号通路抑制心肌细胞自噬目的:明确miR-214是否通过调控PTEN/Akt/mTOR信号通路抑制心肌细胞自噬。方法:1.乳鼠心肌细胞分离和培养:新生1-2天的昆明小鼠表面消毒后取出心脏,D-hanks洗涤心脏,取出心室肌组织剪成小块,消化液消化,直至组织消化完全,收集消化液过滤、离心、重悬后,在含有10%胎牛血清及1%青链霉素的DMEM/F12完全培养基中差速贴壁2h。以0.1m M Brd U的DMEM培养液培养心肌细胞。2.脂多糖诱导的心肌损伤细胞自噬模型的构建:原代培养的乳鼠心肌细胞加入LPS（5μg/m L、10μg/m L、20μg/m L、50μg/m L4个不同终浓度）后培养24小时测定心肌细胞:1)生存率（MTT比色法检测各组细胞活力）2)凋亡率（流式细胞学检测凋亡率）3)自噬（用Western blot检测LC3-Ⅱ/I、p62蛋白水平）4)miR-214表达（RT-qPCR）。根据以上数据,确定LPS实验浓度为10μg/m L。3.LPS对心肌细胞miR-214表达、心肌细胞自噬的作用时间的影响:选择终浓度LPS10μg/m L刺激心肌细胞,分别在6h、12h、18h、24h测定心肌细胞自噬蛋白活性、miR-214表达。4.miR-214过表达和抑制对LPS诱导的心肌细胞自噬的影响:LPS10μg/m L刺激心肌细胞,同时给予miR-214过表达、抑制剂、阴性对照。24h后测定心肌细胞凋亡,Western blot检测LC3-Ⅱ/I、p62、PTEN、Akt、mTOR等自噬蛋白及自噬通路水平。5.PTEN/Akt/mTOR途径抑制剂处理后对LPS诱导的心肌细胞自噬的影响:Western blot检测LC3-Ⅱ/I、p62自噬蛋白水平。结果:1.在LPS（10μg/m L）诱导心肌细胞损伤24h后,心肌细胞存活百分率随浓度升高逐渐下降,与正常对照组相比均有统计学差异（P<0.05）;2.在LPS作用于心肌细胞6h后,心肌细胞存活百分率随LPS浓度升高逐渐下降,与正常对照组相比均有统计学差异（P<0.05）;3.与对照组相比,LPS（24h）组心肌细胞miR-214的表达水平升高了1.64倍。与对照组相比,miR-214过表达组心肌细胞miRNA-214的表达水平升高了10.15倍,miR-214抑制组心肌细胞miRNA-214的表达水平降低了72.56%。miR-214过表达空白对照组及miRNA-214抑制空白对照组心肌细胞miR-214的表达,与LPS组相比差异无统计学意义（P<0.05）;4.过表达miR-214能显著降低心肌细胞LC3-Ⅱ/I、PTEN的表达,升高p62、p/t-Akt、p/t-mTOR的表达,即降低脓毒症小鼠心肌细胞自噬;5.抑制miR-214能显著升高低心肌细胞LC3-Ⅱ/I、PTEN的表达,降低p62、p/t-Akt、p/t-mTOR的表达,即升高脓毒症小鼠心肌细胞自噬水平;6.PTEN抑制剂可抑制心肌细胞自噬,增强过表达miR-214抑制自噬的水平。小结:miR-214通过调控PTEN/Akt/mTOR信号通路抑制心肌细胞自噬。