本研究建立了大肠杆菌O157:H7（E.coli O157:H7）液相蛋白芯片检测方法，初步探究了N,N-二甲基乙酰胺（DMAC）作为1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的溶解剂进行微球激活对提高微球耦连效率及检测灵敏度的作用，并应用建立方法对154份实际牛肉样品进行检测。本文具体研究内容如下：1.分离培养E.coli O157：H7标准菌株，经甲醛灭活、超声破碎获得灭活抗原，弗氏佐剂乳化法制备疫苗，免疫Balb/C小鼠，腹水法制备针对E.coliO157：H7致病菌的特异性单克隆抗体并进行单抗特性的评价。（1）制备了两株稳定分泌E.coli O157:H7单抗的杂交瘤细胞株，染色体数目为90，证明融合成功，具有稳定遗传性。（2）对两株单抗特性做了较全面鉴定。结果证明所获得单抗为IgG型；效价为1:512000和1:1024000；抗体蛋白含量为18.459mg/mL和23.014mg/mL；单抗对18种肠道菌特异性良好；亲和常数为1.01×10⁸，为高亲和力抗体；SDS-PAGE条带清晰，杂带少，证明单抗纯度较高；一个月、三个月、六个月后单抗效价无变化，证明单抗稳定性良好。2.制备疫苗免疫新西兰大耳兔，心脏无菌取血，分离纯化制备针对E.coliO157:H7致病菌的多克隆抗体，应用生物素标记试剂盒进行生物素化，计算生物素标记水平。（1）抗体效价为1:64000；与18种肠道菌反应阴性，特异性良好；纯化后蛋白含量44.18mg/mL。（2）最佳多抗纯化条件为35%、100%洗脱液两步洗脱。（3）制备生物素标记多抗，每分子蛋白可标记3分子生物素，适合应用于下一步继续实验。3.探索应用DMAC作为EDC、NHS溶解剂对提高耦连效率的作用。（1）微球与单抗耦连成功，是E.coli O157：H7液相芯片的检测成功建立的基础。（2）分别应用DMAC与H₂O溶解EDC、NHS激活微球进行单抗耦连，测得荧光强度中位数（MFI）分别为3012和2253，即DMAC可明显提高微球与蛋白耦连效率。（3）每次检测（2μL微球）最佳蛋白耦连量为95μg。4.建立了检测E.coli O157：H7的液相蛋白芯片方法。绘制检测曲线，评价该检测方法特异性、灵敏性、重复性。分别应用该方法及H₂O作溶解剂的液相芯片方法检测实际牛肉样品，比较该方法与细菌分离培养法阳性检出率及探索DMAC对阳性检出率的影响。（1）优化检测实验条件，得到最佳生物素标记多抗添加量为76μg；最佳SA-PE添加量为0.5μg；SA-PE最佳反应时间为30min。（2）应用各项最佳反应条件，建立检测方法。建立方法能检出阳性的最低浓度为10³cfu/mL（増菌后），LOD为100cfu/mL；与18种肠道菌无交叉反应，特异性良好；三次重复实验，批间变异系数7.61，重复性良好。（3）应用建立方法检测牛肉样品中人工添加细菌，能检出阳性的最低浓度为0.5cfu/mL（増菌前）。（4）应用建立方法检测154份实际牛肉样品，检出阳性样品19份，细菌培养法检测，检出阳性样品16份。（5）比较分别以DMAC与H₂O作EDC、NHS溶解剂的检测灵敏低，DMAC为溶解剂可检出阳性的最低浓度为10³cfu/mL（増菌后），LOD为100cfu/mL；H₂O为溶解剂可检出阳性的最低浓度为104cfu/mL（増菌后），LOD为10³cfu/mL.（6）分别以DMAC与H₂O作EDC、NHS溶解剂检测154份实际牛肉样品，DMAC为溶解剂可检出阳性样品19份；H₂O为溶解剂可检出阳性样品17份。