单纯疱疹病毒HSV-1是一种传染性极高的嗜神经性病毒,通常会导致宿主身体表面皮肤黏膜的损伤,发生口唇疱疹和单纯疱疹病毒性角膜炎;HSV-1也是散发性脑炎的主要病原体之一,造成单纯疱疹病毒性脑炎,死亡率高。疱疹感染性疾病的发生受到病毒和宿主易感性两方面的影响,其中宿主因素起着关键作用,包括遗传因素、年龄、性别和机体的免疫状态等多种因素。应激可引起机体免疫功能紊乱,诱发各种疾病的产生,尤其是增加感染性疾病的易感性。本课题组前期建立了拘束应激增加小鼠流感病毒易感性模型,发现拘束应激导致的应激激素皮质酮(CORT)上升是增加小鼠流感病毒易感性的主要原因,同时建立了皮质酮负荷细胞流感病毒易感体外模型,使用模型成功评价了多种中药及天然产物降低流感病毒易感性的作用。此外,课题组前期还发现了皮质酮会造成线粒体形态改变和功能下降,可能与增加机体病毒易感性有关,但具体机制需要进一步研究。中药清热消炎宁在临床上对HSV-1引起的口唇溃疡有较好的治疗效果,但目前已报导的清热消炎宁药理机制并不足以解释其临床药效作用。因此,本课题在前期研究的基础上,建立了体内体外HSV-1易感模型,利用模型评价了清热消炎宁(QX)及其活性成分迷迭香酸(RA)对HSV-1易感小鼠/细胞的保护作用,并从线粒体损伤角度对RA降低CORT诱导的HSV-1易感机制进行了探讨。本研究更深入地探讨了CORT诱导HSV-1易感性机制;丰富了本课题组长期聚焦的情志应激增加疾病易感性的研究基础;为潜在具有降低HSV-1易感性的中药及单体药物研究提供药理学及分子生物学依据。首先,本研究建立体内外HSV-1易感模型并探索其可能的易感机制。体内模型实验分组为Control、Stress、Virus、Stress+Virus和RU486+Stress+Virus组,每组7只小鼠,拘束应激条件为每天6 h,持续14天,在第14天进行HSV-1病毒滴鼻感染(5×10~7 PFU/mL,20μL),RU486组在拘束应激前2 h皮下注射RU486(25 mg/kg/day)。观察小鼠一般状态及发病情况,包括小鼠体重变化、发病率、脑炎症状和眼部损伤症状,在实验结束后取脑组织观察病理变化(HE染色),检测小鼠脑组织中的HSV-1病毒滴度(空斑法)、UL54基因(qRT-PCR)、UL27基因(qRT-PCR)和ICP27蛋白(Western blot)。实验结果表明,与病毒组相比,拘束应激HSV-1感染小鼠体重显著下降(p<0.001)、发病率显著增加(p<0.01)、脑炎症状评分(p<0.01)和眼部症状评分(p<0.001)更高,小鼠脑组织中HSV-1病毒相关的UL54基因(p<0.001)、UL27基因(p<0.01)和ICP27蛋白的表达显著上调。体外HSV-1易感模型实验分组为Control、CORT、HSV-1和CORT+HSV-1组,模型组细胞在CORT(50μM)处理48 h后感染HSV-1 F株(MOI=1)。使用qRT-PCR和Western blot法检测HSV-1基因和蛋白发现CORT负荷增加了SH-SY5Y细胞中UL54基因(p<0.01)、UL27基因(p<0.01)和ICP27蛋白的表达。通过免疫荧光和电镜观察线粒体的变化,结果显示在CORT处理细胞后长柱状或网状的线粒体被破坏成短棒状或者点状,线粒体体积变小,基质染色加深。同时进行转录组测序分析,结果显示与其他代谢途径相比,差异表达基因显著富集于脂质代谢途径,其中,脂质过氧化关键基因ALOX15的转录表达显著增加(p<0.05),由此推测皮质酮负荷诱导的HSV-1易感性可能与线粒体脂质氧化损伤有关。Western blot实验结果表明CORT负荷使SH-SY5Y细胞中ALOX15蛋白和脂质过氧化产物4-HNE增加。使用流式细胞术检测Liperfluo荧光,结果表明CORT负荷使SH-SY5Y细胞Liperfluo荧光增强(p<0.001)。另外,Western blot结果表明ALOX15过表达(ALOX15-GFP)能够使HSV-1 gB和ICP27蛋白表达增加。初步确定ALOX15为研究靶点后,以清热消炎宁的成分九节茶作为化合物来源进行计算机模拟,发现在九节茶主要的9种活性化合物中迷迭香酸与ALOX15相互作用分数最高。第二部分,利用HSV-1易感模型对清热消炎宁和迷迭香酸降低HSV-1易感性的作用进行评价。动物实验分组为Normal、Virus、Model、QX-L(QX 0.658g/kg/day)、QX-H(QX 1.316 g/kg/day)、RA-L(RA 11.7 mg/kg/day)、RA-H(RA23.4 mg/kg/day)和ACV组(阿昔洛韦片0.206 g/kg/day),每组10只小鼠。病毒感染后连续观察小鼠14天,对生存率、体重变化、脑炎症状和眼部损伤症状评分进行统计,结果显示与模型组相比,给药组生存率升高(QX-H:p<0.001,QX-L:p<0.001,RA-H:p<0.01);各给药组小鼠体重下降幅度显著减少(QX-H:p<0.001,QX-L:p<0.01,RA-H:p<0.001,RA-L:p<0.01);脑炎症状分数第10天开始有显著差异(QX-H:p<0.001,QX-L:p<0.01,RA-H:p<0.05,RA-L:p<0.05);眼部损伤分数第9天开始有显著差异(QX-H:p<0.001,QX-L:p<0.001,RA-H:p<0.01,RA-L:p<0.01)。观察脑组织病理变化(HE染色),结果显示与模型组相比,各给药组脑组织炎性细胞浸润减少。检测脑组织中的病毒滴度(空斑法)、HSV-1 ICP27蛋白(Western blot)和HSV-1抗原分布(免疫组织化学),结果表明,与模型组相比,给药组小鼠病毒滴度显著减少(QX-H:p<0.001,QX-L:p<0.01,RA-H:p<0.01,RA-L:p<0.01);HSV-1 ICP27蛋白表达下调;脑组织矢状面切片HSV-1抗原阳性染色减少。使用空斑法筛选RA降低CORT诱导的HSV-1易感的有效浓度,实验分组为Control、HSV-1、CORT+HSV-1、RA+CORT+HSV-1,结果显示与CORT+HSV-1组相比,RA+CORT+HSV-1组RA在100μM时病毒滴度显著减少(p<0.05),并通过Western blot检测HSV-1 gB和ICP27蛋白进行验证,结果显示与CORT+HSV-1组相比,RA+CORT+HSV-1(RA 100μM)组gB和ICP27表达下调。采用Western blot检测线粒体抗病毒信号通路MAVS、p-IRF3和IFN-β蛋白的表达,结果显示与CORT+HSV-1组相比,RA+CORT+HSV-1组MAVS、p-IRF3和IFN-β表达上调。第三部分,对RA减少CORT诱导的线粒体氧化损伤作用进行研究。采用Western blot和脂加氧酶抑制剂筛选试剂盒检测RA对ALOX15表达和活性的影响,实验结果表明,与CORT组相比,RA+CORT组中ALOX15蛋白表达无明显变化,而RA对ALOX15活性有抑制作用,抑制率为92.75%。接着研究ALOX15在CORT诱导的脂质过氧化物堆积中的作用,实验分组为Control、ALOX15-flag、ALOX15-flag+RA、CORT、ALOX15-flag+CORT和ALOX15-flag+RA+CORT组。通过流式细胞术和Western blot检测细胞脂质过氧化物堆积,并且通过激光共聚焦检测线粒体与脂质过氧化物的共定位,结果显示ALOX15过表达条件下CORT诱导的Liperfluo荧光(p<0.001)和4-HNE增加,Liperfluo与Mito Red共定位增加,而同时给予RA处理的组Liperfluo荧光(p<0.001)和4-HNE减少,Liperfluo与Mito Red的共定位减少。通过流式细胞术和Western blot检测RA对CORT诱导的脂质过氧化物堆积的影响,结果显示与CORT组相比,RA+CORT组Liperfluo荧光强度(p<0.001)和4-HNE减少。通过激光共聚焦检测线粒体与脂质过氧化物的共定位,结果显示与CORT组相比,RA+CORT组Liperfluo与Mito Red的共定位减少。通过免疫荧光对线粒体形态进行观察并且对其网络形态进行统计,结果显示与Control组相比,CORT处理后的细胞线粒体网络形态断裂,点状和棒状结构(p<0.001)和网络结构数目(p<0.001)明显增加、网络分支长度(p<0.01)和分支程度(p<0.01)减小,而与CORT组相比,给予RA可以恢复CORT诱导的网络形态断裂,点/棒状结构(p<0.01)和网络结构(p<0.001)数目减少、网络分支长度(p<0.05)和分支程度(p<0.01)增加。通过流式细胞术对线粒体膜电位和细胞ROS水平进行检测,结果表明与Control组相比,CORT组JC-1探针绿色荧光增强,红色荧光减弱,线粒体膜电位降低;而与CORT组相比,RA可以恢复CORT诱导的线粒体膜电位(p<0.001);与Control组相比,CORT组DCFDA荧光增强(p<0.001),ROS水平增加;而与CORT组相比,RA+CORT组DCFDA荧光减少(p<0.01),ROS水平降低。综上所述,拘束应激和应激激素CORT能够在体内外模型中诱导HSV-1易感;CORT负荷能够使细胞及线粒体脂质过氧化水平增加、ALOX15表达上调、细胞线粒体断裂;而QX和RA能降低HSV-1易感性,其作用机制涉及抑制ALOX15、降低ALOX15介导的脂质过氧化物堆积、减少CORT诱导的线粒体损伤及增加线粒体抗病毒信号通路MAVS、p-IRF3和IFN-β蛋白的表达,可能通过增强线粒体的抗病毒免疫减少HSV-1的复制。