在科学技术日新月异的今天,随着分子生物学和微电子技术的飞速发展,快速、准确、特异检验的微生物新技术、新方法不断涌现,微生物检验技术由培养水平向分子水平迈进,并向仪器化、自动化、标准化方向发展,提高了微生物检验工作的高效性、准确性和可靠性。但是在药品检验领域,微生物鉴定技术甚少。菌株随着环境的变迁不断发生着遗传变异,许多控制菌株在按照标准检验时,周期长,有时出现假阴性。目前,中国药典逐渐与欧洲药典、美国药典和日本药局方协调一致,在控制菌鉴定方面也做出了“适宜的鉴定方法确证”的要求。因此,获得适宜的控制菌检查和鉴定技术是检验结果高效、准确和可靠的基本保证。铜绿假单胞菌,是临床常见重要条件致病菌之一,也是药典收载的局部用药的重要控制菌,有较高的死亡率。其易定植、易变异和多耐药,广泛存在于土壤、水、空气及人体皮肤、呼吸道与肠道。目前,该菌是药品、化妆品以及实验动物检验中一项重要的微生物控制指标。对于正常样品来讲,一般需经过灭菌处理,残存菌株都或多或少受过不同程度的损伤,要通过某些培养基复苏到能够被检出的程度,势必需要满足灵敏度高、起始增菌时间短、增菌浓度高的要求。虽然药典明确提出了培养基适用性检查的必要,但是来源不同的培养基,即使满足了中国药典或其它标准的基本要求,其灵敏度也有一定差异。由于检测仪器的限制,要获得较多的实验数据,检验工作极其繁琐,是该类微生物实验进行的一个瓶颈问题。传统鉴别方法日益暴露出种种弊端,越来越不适应消费者快餐式的现代消费理念。在追求快速、简便检测的同时,更希望结果的准确性。本课题以铜绿假单胞菌为典型代表,选择不同来源的9株阳性菌株和国内外16种培养基利用酶标仪在线检测OD值绘制生长曲线的方式,重点探索最适宜的液体增菌培养基和培养条件,大大减少了工作量,走在了增菌培养基筛选技术的前沿。同时对上述9株阳性菌株生化鉴定及分型方法做了进一步的探索实验。目的:采用择优录取的方式,在一定培养条件下,评选出优质、高灵敏度的液体增菌培养基;采用传统鉴定方法、国际金标准鉴定技术、荧光检测和基因分型,从而在最直接、最经济的鉴定与基因分型方法检验过程中发现隐含的漏检因素,为药品、化妆品以及实验动物检验提供参考。方法:液体增菌培养基和培养条件的筛选,通过对生长曲线图中关键参数和绿脓菌素的浓度、菌膜生长情况对比情况,择优录取。将新鲜菌株进行传统方法鉴定、API试剂条鉴定、VITEK 2 compact型全自动微生物分析系统鉴定、血清分型、荧光定量PCR鉴定、RAPD基因分型。结果:TSB培养基是最符合质量要求的一种液体培养基,并且国内外各生产单位提供的产品质量差异很小。在35℃培养条件下最适宜的增菌时间是48小时,适当的延长增菌时间增加阳性检出率,如有必要可以延长至72小时。传统鉴定方法、API试剂条鉴定、VITEK 2 compact型全自动微生物分析系统鉴定、血清分型、荧光定量PCR鉴定,阳性检出率均为100%;RAPD基因分型,阳性检出率为0%。结论:筛选的TSB培养基,在一定培养条件下,灵敏度高、起始增菌时间短、增菌浓度高,最适于铜绿假单胞菌的增菌。采用传统鉴定方法,有时遇到菌株不同程度表型变异,使绿脓菌素或菌膜的产生时有时无,引起生化试验鉴别反应变动。因而单纯依靠绿脓菌素或菌膜的有无决定是否进一步试验,可能有些片面。API试剂条鉴定和VITEK 2 compact型全自动微生物分析系统鉴定全部检出阳性菌株,鉴定率为100%。API试剂条读数受人为因素影响较大,后者则避免了人为误差,鉴定结果较为可靠。采用免疫血清结果的可靠性影响因素较多,除了灵敏度外,还和菌龄、菌株分纯程度、使用工具的材质及洁净程度等有关。操作虽简单,但结果重复性差。RAPD基因分型技术需提供的DNA样本纯度高,即对DNA提取的试剂及试验过程要求较高。相比之下荧光定量PCR鉴定仪的灵敏度更高些,但直接经过裂解的产物和在有其它相似菌株存在的情况下,特异性还需要进一步改进。即便是在同一样本下,厂家提供的和本人做出的检验结果有些出入,除了操作误差外,还和试剂添加比例、试剂理化性质、PCR仪器的灵敏度有一定关系。