论文部分内容阅读
猪细小病毒病(Porcine parvovirus infection,PPI)又称猪的繁殖障碍病,是由猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)引起的一种猪的繁殖障碍病。猪是唯一的易感动物。PPV主要感染妊娠前期的母猪,引起母猪流产、胚胎死亡、胎儿畸形、木乃伊化、弱胎及不孕等危害,给养猪业造成了重大损失。因此,控制PPI对养猪业具有十分重要的意义。本研究对经PCR进行扩增的PPV核酸阳性的病料进行处理后,在猪睾丸(Swine testicular cells,ST)细胞上进行病毒分离,获得1株PPV,命名为PPVGD。对获得的PPVGD分离株进行了病毒的耐脂溶剂、耐酸、耐热及耐胰酶的理化特性鉴定,这些特性与PPV相符。根据GenBank上已公布的PPV序列,设计合成引物,对PPVGD分离株基因组进行PCR扩增并进行序列测定,获得包含全部编码区4251 bp的基因组序列。将PPVGD分离株与GenBank公布的44株PPV参考毒株NS1基因和55株PPV参考毒株的VP2基因的核苷酸序列、氨基酸序列分别进行比对分析,并绘制进化树。核苷酸序列相似性分析表明:PPVGD分离株的NS1基因的核苷酸序列与中国分离株HN-G、HN-H、HN-K的相似性最高,为99.9%,与33760005-3a株的相似性最低,为98.2%。PPVGD分离株的VP2基因的核苷酸序列与美国经典株NADL-2和POVNADL-2的相似性最高,为99.7%,与15425株最低,为98.1%。氨基酸序列相似性分析表明,PPVGD分离株的NS1基因的氨基酸序列与中国分离株HN-G、HN-K、J-PPV和NJ及美国毒株NADL-2、POVNADL-2和Kresse的相似性最高,为99.7%;与33760005-3a株的相似性最低,为98.0%。PPVGD分离株的VP2基因的氨基酸序列与中国分离株HN-I和美国毒株NADL-2和POVNADL-2的相似性最高,为99.0%;与WB-773和21620005-1h株的相似性最低,为96.4%。本研究将PPVGD分离株在ST细胞上增殖,并对病毒增殖条件进行了优化,获得了大量的病毒液,为疫苗的制备奠定了基础。培养的PPVGD病毒液的血凝效价可达1:29。利用获得的病毒液,按照中国生物制品规程制备了PPV分离株的油乳剂灭活疫苗。制备的PPVGD灭活疫苗分别免疫350 g左右健康豚鼠和4月龄左右的后备母猪。豚鼠免疫28 d后采血、后备母猪免疫14 d后、28 d后分别采血。后备母猪28 d时加强免疫一次,加强免疫14 d后再采血,对免疫动物的血清分别进行血凝抗体效价的测定。结果表明,豚鼠和后备母猪免疫28 d后的HI抗体效价均达1:26以上,表明该疫苗具有良好的免疫原性。并且免疫PPVGD灭活疫苗后,均无不良反应,表明疫苗的安全性好,为疫苗的进一步研制奠定了基础。