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共轭亚油酸(Conjugated linoleic acid,CLA)是具有共轭双键的十八碳二烯酸的位置和几何异构体的统称,具有抗癌、抗动脉粥样硬化和降脂等生理功效。利用生物法合成的CLA生物活性强且食用安全,是合成CLA的最佳选择。乳酸菌可以通过体内的共轭亚油酸水合酶(Conjugated linoleic hydratase,CLA-HY)、羟基脂肪酸脱氢酶(Hydroxy fatty acid dehydrogenase,CLA-DH)和共轭亚油酸乙酰乙酸脱羧酶(CLA acetoacetate decarboxylase,CLA-DC)组成的亚油酸异构酶系将亚油酸(Linoleic acid,LA)转化为CLA,并且具有易于大规模培养和安全性高等优势。因此,开发可合成CLA的乳酸菌、研究其合成CLA的途径、探明亚油酸异构酶系的结构与功能的关系以及寻找提高CLA产率的途径对于实现生物法合成CLA工业化具有重要意义。植物乳杆菌p-8是内蒙古自治区特有的分离于传统发酵酸奶中的一株益生菌,其可以将LA异构化为CLA。本研究首先采用气相色谱法对植物乳杆菌p-8体内发酵催化LA及其天然酶和重组酶体外催化LA的产物进行分析,研究了该菌株合成CLA的能力、途径和异构体组成。其次,结合同源建模法、分子对接技术和氨基酸残基突变技术,分别对异源表达的植物乳杆菌p-8亚油酸异构酶系中的CLA-HY和CLA-DH的结构与功能的关系进行研究。论文的主要研究结果如下:(1)植物乳杆菌p-8在含有LA的MRS中培养后,分析发酵上清液以及菌体破碎液体外再催化LA后的脂肪酸,结果发现都有少量的3种CLA异构体出现,分别为 cis9,trans11-CLA(c9,t11-CLA)、trans10,cis12-CLA(t10,c12-CLA)和 trans9,trans11-CLA(t9,t11-CLA);对发酵后的菌体进行脂肪酸分析,只发现极少量的t10,c12-CLA。利用大肠杆菌分别异源表达CLA-HY、CLA-DH和CLA-DC后,将三个重组酶用于混合和分步体外催化LA,对各步反应产物中的脂肪酸组成进行分析,结果表明只有三个重组酶都存在且有黄素腺嘌呤二核苷酸(Flavin denine dinucleotide,FAD)、还原态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide hydrogen,NADH)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)的辅助作用下,才可完成LA转化为3种CLA异构体;分步催化时,首先加入CLA-HY和FAD催化后产物中出现少量的10-羟基-顺12-十八碳烯酸(10-hydroxy-cis-12-octadecarenoic acid,10-HOE)和 t10,c12-CLA,再加入 CLA-DH和NAD+催化后产物出现了 10-氧代-顺12-十八碳烯酸,再加入CLA-DC和NADH催化后产物中出现了 c9,t11-CLA、t10,c12-CLA和t9,t11-CLA,最后再依次分步加入CLA-DH和CLA-HY进行催化,依然出现CLA的3种异构体,推断出该菌转化LA生成CLA的途径与植物乳杆菌AKU1009a一致。(2)以红串红球菌的油酸水合酶(Rhodococcus erythropolis oleate hydratase,OhyRe)的晶体结构为模板,同源建模分析CLA-HY的三维结构,发现CLA-HY属于肌球蛋白交叉反应抗原(Myosin cross reactive antigen,MCRA)蛋白超家族,其三维结构中包含三个结构域,N端是与FAD结合的Rossman折叠,对应于氨基酸序列GAGLSN(X)23D(10-45)。分析CLA-HY和植物乳杆菌ATCC8014的共轭亚油酸水合酶(Lactobacillus plantarum hydratase,LPH)分别与LA分子对接的结果,发现有2个位点共20个氨基酸残基与LA互作,有28个氨基酸残基与FAD结合有关。据此,用基因工程手段获得重组CLA-HY及其22个点突变体和2个缺失突变体,其中有4个突变体是包涵体形式,说明这4个突变位点Met 201、Leu 144、Ile 148和Met 149与CLA-HY的可溶性有关。重组CLA-HY可以将LA转化为10-HOE,其最适反应温度为35℃,最适反应缓冲体系是KPB缓冲液(20 mM,pH 6.0)。经酶活力分析发现CLA-HY-Y82F、△TGYVARGG和△SBS完全失去活力,说明Tyr 82是催化基团,并且这两段肽段对CLA-HY发挥活性至关重要。结合动力学参数、三维结构和分子对接的结果,进一步对CLA-HY和剩余的17个点突变体进行分析,结果表明Met204、Gly 74、Arg 75、Met76、Thr 185、Phe 186、His 399、His 403 和Trp 415与LA的结合密切相关,Gly 74与FAD的结合有关,Met 76与FAD的结合和LA的固定都有关。此外,CLA-HY-M204A可显著提高催化效率。(3)以瘤状伯克霍尔德菌的SDR蛋白晶体结构为模板,同源建模获得CLA-DH的三维结构,发现CLA-DH属于一个短链脱氢/还原酶(short-chain dehydrogenases/reductase,SDR)蛋白超家族,CLA-DH单体的N端有该家族中高度保守的与NAD+/NADH结合的Rossman折叠,C端是特异的底物通道入口,同时具有该家族高度保守的催化四联体。将10-HOE和蓖麻油酸分别与CLA-DH进行分子对接并分析,结果显示,有一个由26个氨基酸残基组成的与10-HOE互作的位点,有一个由27个氨基酸残基组成的与蓖麻油酸互作的位点。据此,用基因工程手段获得重组CLA-DH及其28个点突变体,其中13个突变体是包涵体形式,说明CLA-DH的这 13 个突变位点 Pro 188、Thr 12、Gly 13、His 16、Phe 18、Asp 37、Asp 63、Ala 91、Gly 92、Ile 113、Val 141、Lys 160 和 Phe 190 与 CLA-DH 的可溶性有关。以蓖麻油酸为底物时,重组CLA-DH的最适反应温度为45℃,最适反应缓冲体系是KPB缓冲液(20 mM,pH 6.0)。结合动力学参数、三维结构和分子对接的结果,进一步对CLA-DH和剩余的15个点突变体进行分析,结果表明CLA-DH的Ser 143是与CLA-DH 催化相关的氨基酸残基,CLA-DH 的Ile 38、Asn 90、Ile 93、Thr 193 和 Val 229是与蓖麻油酸的结合相关的氨基酸残基,Tyr 156与底物的结合和酶的催化均有关。CLA-DH-N90G、CLA-DH-I93S、CLA-DH-Y156G、CLA-DH-T193A 和CLA-DH-V229D 5个突变体的催化效率显著提升,而CLA-DH-I38S和CLA-DH-S143A催化效率和酶的比活力显著下降。