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目的:研究188Re-DTPA-DG导致肿瘤细胞辐射损伤,探讨其作用途径及可能机制。
方法:配制不同pH值的磷酸缓冲液,取300~400μL,加入0.5mol/L的葡萄糖酸钠100μL,室温下用电子天平称取10mg的二乙三胺五乙酸-2-脱氧葡萄糖,加入新淋洗的188REO4-100~200μL,采用正交分析法,分别在不同pH值、不同SnCl2用量、不同反应温度、不同反应时间下,寻求188-高铼酸盐标记二乙三胺五乙酸-2-脱氧葡萄糖的最佳条件;分别培养MCF-7及A549肿瘤细胞株,收集对数生长期MCF-7细胞,调整细胞浓度约为4×105个/mL。取30只一次性试管,每管加100μL乳腺癌MCF-7细胞悬液,设188Re-DTPA-DG实验组和188ReO4-对照组,分30分钟、1h、2h、3h、4h五个不同时间段,每个时间段每组设三个复管;实验开始实验组和对照组中分别同时加入188Re-DTPA-DG和188ReO4-淋洗液3.7KBq/10μL,置于37℃5%CO2孵箱中。伽玛计数仪检测5个不同时间点MCF-7细胞对188Re-DTPA-DG(3.7kBq/10μL)的摄取;收集人肺癌细胞A549对数生长期细胞,用PBS洗涤3次,用RPMI1640培养液吹打成单细胞悬液,调整细胞浓度为6×105个mL-1。取96孔培养板,每孔100μL细胞悬液,共45孔,置于37℃,5%CO2孵箱中培养1天,吸去培养液,加入不含酚红的RPMI1640培养液,依次序对应加入不同浓度的188Re-DTPA-DG和游离188ReO4-:
(1)实验组(188Re-DTPA-DG)148、296、444MBq/L;
(2)对照组(188ReO4-淋洗液缓冲液及等量DTPA-DG)148、296、444MBq/L;
(3)生理盐水组(含相同体积生理盐水及缓冲液)。
A549人肺癌细胞在培养板中培养过夜,每组设五个复孔,总体积为500μL。倒置显微镜下观察细胞形态;每孔加入5mg/mL的MTT10μL,继续培养4h。
MTT法比较不同浓度148、296、444 kBq/mL 188Re-DTPA-DG与188REO4-对A549肿瘤细胞的毒性效应;取乳腺癌MCF-7对数生长期细胞5×104个/100μL,接种于24孔培养板,置于37℃5%CO2孵箱中培养24h后,分组:
(1)实验组188Re-DTPA-DG设三个不同浓度37、55.5、74 kBq/mL;
(2)188ReO4-对照组亦设三个不同浓度37、55.5、74 kBq/mL;
(3)生理盐水组乳腺癌细胞(MCF-7)在加入相同体积生理盐水的RPMI1640培养液中继续培养;每组设三个复孔。总体积为1000μL。
用流式细胞技术检测不同浓度37、55.5、74 kBq/mL188Re-DTPA-DG与188ReO4-下导致的MCF-7肿瘤细胞的辐射凋亡效应;荷人乳腺癌MCF-7裸鼠2只,分别从尾静脉注射37MBq/mL的188Re-DTPA-DG和188ReO4-0.1mL,注射后30分钟、2h分别进行静态采集,采集条件;矩阵128 X 128,放大倍数3倍,观察显像效果。选择体重25g左右的雌性裸鼠,在左大腿皮下接种人乳腺癌MCF-7细胞株,细胞用量0.2ml,约含瘤细胞1×107个,接种后约2周,待肿瘤直径长至约1.0cm时用于实验。乳腺癌MCF-7裸鼠9只,分3组,每组3只,经尾静脉注射188Re-DTPA-DG3.7MBq/0.1 ml,注射后3h、12h、24h断头处死裸鼠,取血、心、肺、肝、脾、肾、胃、小肠、肌肉、肿瘤等组织器官,称重并测其放射性计数,计算每克组织百分注射剂量率(%ID/g)、计算器官/血液比值和肿瘤/肌肉(T/NT)比值。将处于对数生长期的MCF-7乳腺癌细胞以1×107ml-1接种于体重约17g的裸鼠右前肢皮下,瘤体直径约10mm。将接种后已形成瘤体的裸鼠随机分为3组,每组三只。第1组为188Re-DTPA-DG,第2组为188REO4-,每组分为3个不同浓度,37、92.5、185MBq/mL(0.1mL/只);第三组为生理盐水组。尾静脉注射,每只注射0.1mL。观察注射不同剂量188Re-DTPA-DG后瘤体的生长曲线。剥离瘤体,称重,HE染色,比较染色结果。
结果:标记结果显示,在pH值约5.5,温度约为38℃条件下,标记率最高,达95.2%;188Re-DTPA-DG能被MCF-7细胞摄取,4小时摄取率达15.6%,摄取率随时间延长而增加,实验组和对照组在不同时段均有显著性差异(P<0.05),对照组基本不摄取,实验组随着时间延长摄取率逐渐升高,且30min与4h间差异显著(P<0.05);对照组不同时间段间无显著性差异(P>0.05);倒置显微镜低倍镜下观察细胞贴壁,见生理盐水下肺癌A549细胞贴壁良好,18SReO4组及188Re-DTPA-DG组中,细胞贴壁均减少,细胞碎片增多。188Re-DTPA-DG可导致A549肿瘤细胞发生明显的毒性效应,浓度越大,毒性也越明显;流式分析结果表明,188Re-DTPA-DG的辐射电离损伤导致细胞凋亡发生,浓度大,凋亡明显;荷瘤鼠显像,注药后30分钟瘤体即可显示清楚,2小时最清楚;体内分布表明,在瘤体中有大量188Re-DTPA-DG聚集,肿瘤与肌肉放射性比值高,188Re-DTPA-DG主要通过肾脏排泄,脑组织无放射性分布,心肌摄取少;188Re-DTPA-DG对实体瘤体生长有明显的抑制效应,肿瘤组织死亡明显。
结论:188Re-DTPA-DG标记条件方便,标记率高。188Re-DTPA-DG能被MCF-7、A549癌细胞摄取,且对实体瘤有很好的亲和作用;188Re-DTPA-DG具有靶向辐射损伤效应,由于能进入到细胞内,对肿瘤组织细胞可以发挥更为精确的辐射损伤,从而导致细胞凋亡,抑制肿瘤生长;其可能的机制为电离辐射损伤,特别是发生在细胞内的电离所产生的自由基造成的损伤广泛且超出了细胞修复能力,于是启动了凋亡。