论文部分内容阅读
目的:糖尿病肾病（Diabetic kidney disease,DKD）是糖尿病最严重的并发症之一。在我国的发病率越来越高,目前已成为终末期肾脏病（End stage renal disease,ESRD）的第二位原因,仅次于各种肾小球肾炎。许多研究显示糖尿病引起的长期高血糖会导致肾脏细胞炎性浸润,加重肾组织的损伤。课题组前期研究开发的姜黄素衍生物FM0807具有良好的抗炎、抗氧化作用。因此,本文旨在探讨FM0807对糖尿病小鼠肾损伤的治疗作用及其可能机制,为改善DKD提供新的治疗依据。方法:1、体内实验:采用8周龄SPF级野生型db/m小鼠和原发型db/db 2型糖尿病小鼠,db/m小鼠和db/db小鼠随机分为6组:正常组（Control）、模型组（Model）、阳性药贝那普利组(Model+Benazepril 2 mg·kg-1)、FM0807低剂量组(Model+25 mg·kg-1)、FM0807中剂量组(Model+50 mg·kg-1)和FM0807高剂量组(Model+100 mg·kg-1)。正常组给予生理盐水,阳性药组给予贝那普利（溶于生理盐水后）,FM0807按既定剂量,每两天灌胃给药一次,定期监测体重和血糖水平,记录小鼠的精神状态和一般情况。连续给药8周后,处死小鼠,取肾组织进行苏木素-伊红（HE）、糖原（PAS）、马松（Masson）和六胺银染色,观察小鼠肾组织病理形态学、胶原纤维、糖原、基底膜厚度的变化;q RT-PCR检测肾脏炎症因子相关蛋白（JAK2、STAT3等）及其m RNA的表达;取血浆检测肾组织生化指标（CRE、BUN、TG等）的变化;取尿液,检测小鼠24h尿蛋白的变化。2、体外实验:以大鼠肾小球系膜细胞（HBZY-1）为体外模型,采用D-葡萄糖(25 mmol·L-1)诱导建立高糖模型。细胞分组如下:正常组（Control）、模型组（Model）、阳性药组（JAK2特异性抑制剂Model+AG490 50μM）、FM0807低剂量组（Model+25μM）、FM0807中剂量组（Model+50μM）、FM0807高剂量组（Model+100μM）。MTT法观察不同浓度FM0807对HBZY-1细胞活力的影响;高内涵细胞成像分析法检测HBZY-1细胞凋亡的影响,流式细胞术测定HBZY-1细胞凋亡率的水平;活性氧（Reactive oxygen species,ROS）检测试剂盒检测细胞氧化水平的变化;Western blot测定HBZY-1细胞增殖（Bcl-2、Bax）和炎症信号通路（JAK2、STAT3、IL-1β）相关蛋白的表达水平;q RT-PCR检测相关炎症因子（JAK2、STAT3、IL-18）m RNA的表达水平。结果:1、体内实验:（1）FM0807可以降低db/db小鼠血糖、糖化血红蛋白（Ghb）和24h尿蛋白水平;降低db/db小鼠甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、肌酐（CRE）和尿素氮（BUN）水平,提高高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平,并且与FM0807具有剂量依赖性。（2）HE染色结果显示,在Model组小鼠中肾小球明显增大,形状不规则,鲍曼式囊腔黏连,给予FM0807干预后,肾小球体积缩小,形态变得规则,鲍曼式囊腔黏连减轻。Masson染色结果显示,Model组小鼠肾组织胶原纤维增加,FM0807干预后肾脏胶原纤维增加明显减少。PAS染色结果显示,Model组小鼠糖原累积情况明显增加,给予FM0807干预后肾组织糖原累积减少。六氨银染色结果显示Model组小鼠肾小球系膜增生、基底膜明显增厚,给予FM0807干预后肾小球系膜和基底膜增厚的现象明显减少。染色结果显示各种病理损伤均随着FM0807的剂量增加而改善程度更佳。（3）q RT-PCR结果显示,与Control组小鼠相比,Model组小鼠肾组织中炎症和纤维化相关因子JAK2、STAT3、IL-1β、TNF-α和CTGF m RNA的表达水平明显上升,给予FM0807治疗后各m RNA表达水平下调,且呈剂量依赖性,差异具有统计学意义。（4）Western blot结果显示,与Control组相比,Model组小鼠JAK2、STAT3及其磷酸化形式表达均有上调,抗凋亡蛋白Bcl-2与促凋亡蛋白Bax的比值升高,炎症和纤维化相关蛋白NLRP3、Smad2/3、IL-1β、IL-18表达增加,给予FM0807治疗后,上述蛋白表达降低,Bcl-2/Bax比值降低,表示FM0807具有缓解糖尿病小鼠肾脏炎症反应和纤维化进展的作用。2、体外实验（1）MTT法确定诱导HBZY-1细胞高糖模型的D-葡萄糖浓度为25 m M,FM0807对HBZY-1细胞的IC50值为38.76μM,因此确定FM0807的给药剂量为25μM、50μM、100μM。倒置显微镜下可以观察到,高糖能促进HBZY-1细胞增殖,而给予AG490和FM0807可以抑制高糖诱导的细胞增殖。（2）流式结果显示与Control组相比,Model组细胞凋亡率明显降低,给药AG490和FM0807后HBZY-1细胞的凋亡率升高,提示FM0807和AG490可以抑制高糖诱导的HBZY-1细胞的增殖,促进细胞的凋亡。（3）ROS检测试剂盒检测结果显示,与Control组相比,Model组细胞ROS水平明显增加,给予AG490和FM0807治疗后,HBZY-1细胞的ROS表达水平降低,提示AG490和FM0807可以降低高糖诱导的HBZY-1细胞的氧化应激水平。Mito-Tracker Red CMXRos（线粒体红色荧光探针）检测线粒体膜电位,染色结果表明,Model组细胞线粒体膜电位升高,给药AG490和FM0807后线粒体膜电位降低,表明AG490和FM0807可以促进高糖诱导的HBZY-1细胞的凋亡。（4）Hoechst 33342/PI染色试剂盒检测HBZY-1细胞的凋亡水平,高内涵细胞成像分析系统检测结果显示,与Control组相比,Model组细胞PI染色降低,给予AG490和FM0807后HBZY-1细胞PI染色明显增加,表明AG490和FM0807可以促进高糖诱导的HBZY-1细胞的凋亡。（5）RT-PCR和Western Blot结果显示高糖会诱导JAK2、STAT3、IL-1β、TGF-β1等炎症因子的表达,还会促进抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,促进NLRP3相关通路蛋白的表达引发细胞的炎症反应,促进纤维化通路相关蛋白的表达加重肾组织纤维化,而给予AG490和FM0807后相关促炎因子和促纤维化蛋白表达显著降低,表明AG490和FM0807可以抑制高糖诱导HBZY-1细胞的炎症反应和纤维化的进展。结论:1、FM0807具有改善糖尿病肾损伤小鼠肾功能的作用。2、FM0807可显著降低JAK2、STAT3基因水平和蛋白水平的表达。3、高糖能促进HBZY-1细胞的异常增殖和纤维化,FM0807能抑制HBZY-1细胞的异常增殖和纤维化水平。4、FM0807主要通过调控JAK2/STAT3信号通路来缓解炎症反应和上皮细胞间充质转化,从而改善糖尿病引起的肾损伤。