天山堇菜(Viola tianshanica Maxim.)为堇菜科(Violaceae)堇菜属植物,广泛分布于中亚地区,尤其在中国的新疆地区广泛分布,以全草入药。全草主要用于各种发热、受寒、感冒、胸膜炎、肺炎、咽炎、疗疮肿痈等症。其气味微苦辛、凉,清热解毒,具有调理、软化、发汗的作用。主要用于轻泻异常胆液质,调节血液热性过盛,生津止渴,发汗退烧。其药用部位是全草,全草经预实验检出含挥发油、黄酮类、生物碱、氨基酸、粘液质皂苷、鞣质等[1]。文献报道天山堇菜提取物具有明显的抗炎[2]、抗菌[3]及抗氧化[4]等作用。目前对其中的化学成分研究较少,文献报道其中含有的化学成分有黄酮[5]和环肽[‘]类成分。本研究从抗补体活性、抗菌活性、抗病毒活性及抗细胞毒活性等方面对天山堇菜的生物活性进行研究,发现天山堇菜的石油醚部位、乙酸乙酯部位抗补体作用较好,且乙酸乙酯部位也具有较广的抗菌谱和较强的抗细胞毒活性,正丁醇部位具有抗流感病毒25%的活性抑制作用。本课题对生物活性部位进行分离研究,从石油醚部位,乙酸乙酯部位,正丁醇部位共分离鉴定了 37个化合物。采用细胞溶血法测定了所有化合物对经典和旁路途径的抗补体活性,并选择黄酮及其苷类和木脂素苷类化合物进行了抗补体作用靶点的研究。此外还比较研究了天山堇菜和紫花地丁中挥发性成分的GC-MS分析和极性较大成分的UPLC-QTOF分析,发现两者在化学成分上存在差异,这些差异性成分的存在可能会导致治疗效果的不同,值得进一步的药效学研究。主要研究结果如下:1.天山堇菜生物活性部位的确定抗补体活性部位的确立,采用体外细胞溶血法考察了中药天山堇菜提取物不同萃取部位的抗补体活性。结果发现天山堇菜乙酸乙酯萃取物(CH50=0.011士0.01 mg/ml)抗补体活性强于石油醚萃取物(CH50=0.023±0.01 mg/ml),正丁醇萃取物(CH50=0.253±0.01 mg/ml),水部位萃取物(0.547±0.01 mg/ml)。天山堇菜抗菌抗病毒活性部位的确定,天山堇菜的提取物对金黄色葡萄球菌,大肠杆菌,肺炎球菌,MRSA菌及绿脓杆菌具有一定的抑制作用。其中发现天山堇菜的乙酸乙酯提取物对金黄色葡萄球菌,绿脓杆菌具有较好的抑制活性,且抑菌圈大小在10 mm-15 mm;对肺炎球菌及MRSA菌具有抑制活性,且抑菌圈大小在6 mm-10 mm。正丁醇提取物对肺炎球菌具有较好的抑制活性,且抑菌圈大小在10 mm-15 mm。水提物对金黄色葡萄球菌,肺炎球菌及绿脓杆菌具有抑制活性,且抑菌圈大小在6 mm-10 mm。同时对提取物进行了体外抗疱疹Ⅰ型病毒及体外抗流感病毒活性筛选实验,结果发现四种提取物对疱疹Ⅰ型病毒均无活性,天山堇菜的正丁醇提取物具有体外抑制流感病毒25%的活性。天山堇菜的抗细胞毒活性部位的确定,对天山堇菜的提取物进行抗肿瘤生物活性体外筛选试验,采用磺酰罗丹明B(sulforhodamiineB,SRB)蛋白染色法对细胞株A549进行活性测定,结果表明乙酸乙酯部位具有抗细胞毒活性(IC50为68.50 μg/ml)。2.天山堇菜生物活性成分研究从天山堇菜石油醚和乙酸乙酯萃取物中分离到37种化合物,其中包括1个木脂素苷类新化合物,是化合物tianshanoside A(18);己知化合物36个,包括17个黄酮氧苷类化合物:山柰酚-3,7-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(1)、山奈酚-3-O-β-D-芸香糖苷(2)、异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖苷(3)、山奈酚-3-Oβ-D-葡萄糖苷(4)、山奈酚-3,7-二-O-α-L-鼠李糖苷(5)、苜蓿素(6)、川藿苷A(7)、山柰酚-3-O-(2"-O-β-D葡萄糖基)-β-D-芸香糖苷(8)、山柰酚-3-O-{α-L-鼠李糖(1→6)-[α-L-鼠李糖(1→2)]}-β-D-葡萄糖苷(9)、山奈酚-3-O-β-D-芸香糖-7-O-β-D-葡萄糖苷(10)、异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖-7-0-β-D-葡萄糖苷(11)、山奈酚-3-(2”,6”-双-O-α-L-鼠李糖)-β-D-葡萄糖苷(12)、芦丁(13)、山奈酚-3-O-β-D-槐糖-7-O-β-D-葡萄糖苷(14)、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖(1→2)-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-葡萄糖苷(15)、异鼠李素-3-O-(2-O-α-L-鼠李糖-6-O-β-D-葡萄糖)-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-葡萄糖昔(16)、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖(17);3个木脂素类化合物:Aketrilignoside B(19)、苦木苷(20)、丁香苷(21);3酚酸类的化合物:4-羟甲基-2,6-二甲氧基苯基-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(22)、苯乙醇-O-β-D-葡萄糖苷(23)、2,4,6-三羟基苯甲酸乙酯(24);1个含杂原子化合物:2,2’-二硫代二苯并噻唑(25);2个核苷酸类化合物:腺嘌吟核苷(26)、尿啼啶核苷(27);2个留体类化合物:β-谷甾醇(28)、胡萝卜苷(29);6个甘油酯及脂肪族类化合物:十八碳三烯酸单甘油酯(30)、十八碳三烯酸甲酯(31)、2,3-双-顺式亚麻酸甘油酯-1-O-β-D-半乳糖苷(32)、gingerglycolipid A(33)、2,3-双-亚麻酸甘油酯(34)、1,3-双-亚麻酸甘油酯(35);1个单萜化合物:9-hydroxy-4-megastigmen-3-one(36)和1个黄酮碳苷类化合物:芹菜素-6,8-双-C-α-L-阿拉伯糖苷(37)。其中19,20和21化合物是首次从堇菜属ViolαL.植物中分离得到。而紫花地丁中分离得到的化学成分有萜类、香豆素类、黄酮类、生物碱类、木脂素和酚酸类化合物,两者在种类上存在差异。但是制备分离所得到的天山堇菜的化学成分并不能完全反映天山堇菜中的种类,因此需要其他方法来对其中的化学成分进行分析。对具有抗炎作用的挥发性成分,选择GC-MS的研究方法,对其中极性较大部位的化合物采用的是UPLC-QTOF定性鉴定方法。3.采用Needle trap法,顶空直接进样法及水蒸气蒸馏法对天山堇菜和紫花地丁中的挥发性成分进行GC-MS的分析文献[2]报道天山堇菜中的挥发油具有抑制二甲苯致小鼠耳廓肿胀的疗效,因此挥发油具有清热抗炎的作用,有必要对其中的挥发性成分进行研究。本文采用国际上较为先进的动态针捕集技术(Needle trap)对天山堇菜和紫花地丁中的挥发性成分进行分析研究,并且与传统的水蒸气蒸馏法和顶空直接进样法进行了比较。结果发现顶空直接进样法所得的挥发性成分多为低沸点类成分,水蒸汽蒸馏法所得的挥发性成分多为中高沸点类成分,而Needle trap法能够在不破坏挥发性成分的前提下准确的反映挥发性成分的种类(包括低中高不同沸点的成分),具有较好的富集作用和较高的灵敏度。使用Needle trap法对天山堇菜和紫花地丁中的挥发性成分进行分析,通过保留时间,保留指数及相似度比对进行挥发性成分的鉴定,从天山堇菜中共鉴定挥发性成分105个,紫花地丁中鉴定挥发性成分122个,其中两种药材共有的成分为33个,差异性成分存在较多。4.天山堇菜和紫花地丁中的化学成分进行UPLC-QTOF分析本课题对于天山堇菜中极性较大部位的化学成分不清楚,而前期本课题组对紫花地丁的研究中发现,其主要含有的为黄酮碳苷类化合物,因此有必要建立快速有效的方法对天山堇菜药材中的极性较大部位的化学成分进行分析研究,同时也可与紫花地丁中的大极性部位的化学成分进行比较。本研究建立了超高效液相色谱-光电二极管阵列检测-电喷雾离子化-四极杆-飞行时间质谱联用技术对天山堇菜和紫花地丁的黄酮苷类化合物进行结构表征,探讨了黄酮氧苷和碳苷类化合物的裂解规律,黄酮氧苷类化合物的裂解主要发生的是糖基的脱去裂解反应,而黄酮碳苷类化合物裂解的是糖环上的开环裂解反应,并结合黄酮氧苷和碳苷类化合物PDA特征图的差异、对照品的保留时间以及高分辨给出的精确分子量与理论值间的差异对天山堇菜和紫花地丁 75%甲醇提取物中的黄酮苷类化合物进行结构表征,结果从天山堇菜75%甲醇提取物中鉴定出27个黄酮氧苷类化合物和4个黄酮碳苷类化合物;从紫花地丁 75%甲醇提取物中鉴定出22个黄酮碳苷类化合物和5个黄酮氧苷类化合物。这些差异性成分的存在可能会导致两者在治疗效果上的差异,值得进一步的药效学研究。5.单体化合物抗补体活性测定、靶点研究和细胞毒活性研究通过体外细胞溶血实验,对所有的化合物进行了抗补体活性测试,结果表明其中1,2,3,4,5,6,7,8,21和25等11个化合物具有不同程度的补体系统抑制作用,活性化合物主要为黄酮类和木脂素类化合物;对补体系统作用靶点研究结果表明:山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷(4)作用C1q,C2,C4和C9组分,苜蓿素(6)作用于补体C1q,C4和C9组分,苦木苷(21)作用于补体C1q,C3和C9组分。对木脂素类的化合物进行细胞毒活性研究,采用CCK-8法对分离得到的4个木脂素类化合物进行胃癌细胞(Ags)和肝癌细胞(HepG2)细胞毒活性测定,结果表明这4个化合物均不具有抗细胞毒的活性。