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目的:膀胱癌是我国最为常见的泌尿系统恶性肿瘤,在最近的几年中,由于多种因素的综合影响,其发病率在逐渐攀升。在临床上,约四分之三的患者在确诊时被定性为非肌层浸润性膀胱癌,主要的治疗策略为手术切除并辅以膀胱内化疗制剂或生物制剂的灌注治疗,而常用的灌注药物均有不同程度的毒副反应。但是在术后1-2年内,超过半数的病人都会肿瘤复发,而且在复发的患者中约有20%的机率会出现肿瘤的浸润以及转移,导致治疗失败。寻找低毒性且有效的治疗药物,已经成为膀胱肿瘤研究领域的一个难点。 改性柠檬果胶(Modified citrus pectin,MCP)是一种以天然果胶产物作为底物所制取的多糖,主要由半乳糖构成。在以往的研究中发现,MCP是半乳糖凝集素-3(Galectin-3,Gal-3)受体的抑制剂,可以介导多种肿瘤的生长抑制作用。然而,MCP在膀胱癌中的作用效果尚不明了。本论文通过细胞增殖、细胞周期和凋亡分析、Western blot、siRNA敲降等体外实验和膀胱癌异种移植瘤小鼠模型来测试MCP在膀胱癌细胞中可能存在的抑制作用以及机制,可为膀胱癌的药物治疗提供一个新的思路,可降低药物治疗所伴随的毒副反应。 基于以上背景,本论文将以以下思路展开研究:在体外实验中,检测MCP对人膀胱癌细胞株的生长抑制作用,并对其作用机制进行解析,最终在膀胱癌小鼠模型中进一步验证其生长抑制作用。基于上述思路,本文进行了MCP在膀胱癌中的药效学分析与相关的分子机制解析。 方法:MCP的药效学与机制研究:通过SRB法测定了不同浓度MCP对膀胱癌细胞T24和J82的细胞活性抑制,随后通过流式细胞术分析鉴定了MCP处理后细胞的周期阻滞状况,相应的细胞周期蛋白的表达水平经由Western blot分析获得,细胞凋亡水平用Caspase-3检测试剂盒分析获得。基于Western blot的分析结果,针对Galectin-3基因,使用siRNA进行了敲降处理,并测定了细胞增殖,细胞周期阻滞以及细胞凋亡的水平。在体内实验方面,采用不同浓度的MCP对T24小鼠移植瘤模型进行了6周给药处理,最后收集肿瘤样品进行免疫组织化学分析。 结果:MCP可以显著抑制膀胱癌细胞的生长,流式分析结果显示MCP处理的细胞被阻滞于G2/M期,Western blot结果显示细胞周期素B2以及磷酸化Cdc2水平下降;同时Caspase-3被激活,致使Caspase-3以及PARP蛋白的切割作用发生。MCP通过下调Galectin-3的表达,失活AKT信号通路,而MAPK通路活性并未受到影响。后续对Galectin-3基因进行的RNA干扰在细胞增殖、细胞周期阻滞以及细胞凋亡方面都重现了MCP所诱导的抑制作用。2.G9a基因特异的siRNA及BIX-01294处理后的人和小鼠的膀胱癌细胞,其侵袭和迁移能力均明显减弱;而过表达G9a的膀胱癌细胞则呈现出相反的效果。 结论:MCP通过抑制Galectin-3所介导的AKT信号通路来降低膀胱癌细胞的增殖,并促进细胞的G2/M期阻滞与凋亡。