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第一部分肝癌SMMC7721细胞骨形态发生蛋白及其受体表达的研究目的：检测细胞骨形态发生蛋白2、3、4、5、6、7(BMP-2、3、4、5、6、7)及其Ⅰ型受体(BMPR-IA、BMPR-IB)和Ⅱ型受体(BMPR-Ⅱ)在肝癌SMMC7721细胞中的表达。方法：采用RT-PCR检测在肝癌SMMC7721细胞中BMP-2、3、4、5、6、7及其Ⅰ型受体(BMPR-IA、BMPR-IB)和Ⅱ型受体(BMPR-Ⅱ)mRNA水平的表达。采用Western blot检测BMP-2、6及BMPR-IA、BMPR-IB和BMPR-Ⅱ在正常肝细胞和肝癌SMMC7721细胞中蛋白水平表达的差异。结果：1、RT-PCR检测结果显示在人肝癌SMMC7721细胞中,BMP-2基因呈高表达、BMP-6基因呈中等程度表达(相对光密度比值ROD分别为0.81±0.12、0.52±0.13),而BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-7基因仅见微量表达,BMPs受体BMPR-IA、BMPR-IB、BMPR-Ⅱ均见不同程度表达(ROD分别为0.62±0.11、0.73±0.19、0.79±0.22)；2、Western blot检测结果提示正常肝细胞能表达BMP-2、BMP-6,但其表达量明显低于肝癌SMMC7721细胞,二者相比较差异有非常显著统计学意义(P<0.01)；3、Western blot检测结果提示,肝癌SMMC7721细胞能表达BMPR-IA、BMPR-IB、BMPR-Ⅱ,且其表达量与正常肝细胞相比无显著差异(P>0.05)。结论：1、人肝癌SMMC7721细胞中,BMP-2基因呈高表达、BMP-6基因及BMPR-IA、BMPR-IB、BMPR-Ⅱ呈中等程度表达。2、BMP-2、BMP-6在肝癌SMMC7721细胞中表达量明显高于正常肝细胞,BMPR-IA、BMPR-IB、BMPR-Ⅱ在肝癌SMMC7721细胞表达量与正常肝细胞相仿。第二部分BMP-2在原发性肝癌组织中的表达及其临床意义目的研究BMP-2基因在原发性肝癌及正常肝组织中的表达,结合原发性肝癌的临床病理因素,探讨BMP-2基因与原发性肝癌临床病理因素之间的关系。方法：1、采用RT-PCR方法检测BMP-2基因在30例肝癌组织和10例正常肝脏组织中mRNA水平的表达。2、采用RT-PCR、Western blot检测BMP-2基因在不同临床病理参数的肝癌组织中的mRNA和蛋白表达水平,并分析其与临床病理参数之间的关系。结果：BMP-2基因在肝癌组织中呈高表达,而在正常肝组织的表达则明显减弱(P<0.01),BMP-2的表达与临床分期、病理分级、远处转移密切相关(P<0.01)；而与患者年龄、病理分型、AFP以及是否合并肝硬化等因素无明显相关(P>0.05)。结论：BMP-2在原发性肝癌中的表达显著高于相应的正常肝组织中的表达,提示BMP-2的表达是原发性肝癌的重要特征,BMP-2的表达与原发性肝癌的恶性生物学行为密切相关。第三部分siRNA抑制肝癌SMMC7721细胞BMP-2基因表达的研究目的：探讨siRNA干扰对肝癌SMMC7721细胞BMP-2基因表达的影响。方法：设计并合成针对BMP-2的3个siRNA分子序列。分为6组：Ⅰ组为正常对照组(未经转染的细胞)；Ⅱ组为空白对照组(只转染脂质体,无特异性siRNA)；Ⅲ组为阴性对照组(转染非特异性siRNA);Ⅳ～Ⅵ组为转染组(分别转染BMP-2-siRNA-A、BMP-2-siRNA-B及BMP-2-siRNA-C)。阳离子脂质体法瞬间转染SMMC7721细胞,应用RT-PCR和Western blot检测细胞中BMP-2在mRNA水平和蛋白水平的变化。结果：正常对照组、空白对照组、阴性对照组以及BMP-2-siRNA-A转染组、BMP-2-siRNA-B转染组、BMP-2-siRNA-C转染组条带经光密度测定、计算相对光密度比值ROD分别为0.89±0.11、0.93±0.12、0.92±0.14、0.65±0.08、0.32±0.07、0.55±0.07,各组进行比较,可见3个转染组细胞BMP-2表达均明显低于其他对照组(P<0.05)。其中,BMP-2-siRNA-B转染组干扰效果最好,mRNA表达最低,其表达的相对值由(0.92±0.14)降至(0.32±0.07)(P<0.01),而正常对照组、空白对照组和阴性对照组间差异无统计学意义(P>0.05),BMP-2-siRNA-A转染组、BMP-2-siRNA-B转染组、BMP-2-siRNA-C转染组间差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot检测结果显示,BMP-2-siRNA-B组转染后干扰效果最好,BMP-2蛋白表达量的相对灰度值RGS明显下调(0.37±0.10)与BMP-2-siRNA-A, BMP-2-siRNA-C组相比较,差异有显著意义(P<0.05),而正常对照组、空白对照组和阴性对照组间差异无统计学意义。Western blot检测结果与RT-PCR一致。结论：siRNA-BMP-2能明显抑制肝癌细胞SMMC7721的BMP-2表达,以BMP-2-siRNA-B作用最为显著。第四部分siRNA抑制BMP-2表达对肝癌SMMC7721细胞体外增殖和侵袭的影响目的：探讨siRNA抑制BMP-2表达对肝癌SMMC7721细胞体外增殖和侵袭的影响。方法：本研究共分三组：1、空白对照组(SMMC7721-nontransfection,细胞不加转染试剂)；2、阴性对照组(SMMC7721-siControl,,转染非特异性siRNA);3、实验组(SMMC7721-siBMP-2,转染BMP-2 siRNA)。用MTT检测、流式细胞仪、平板黏附模型、划痕“愈合”模型以及Matrigel体外侵袭实验等方法观察三组细胞增殖、凋亡以及黏附、迁移、侵袭能力的改变。结果：1、MTT法检测结果显示转染24小时后,SMMC7721-siBMP-2组SMMC7721细胞增殖水平与空白对照组和阴性对照组比较无显著性差异(P>0.05),而48小时及72小时后SMMC7721细胞增殖水平明显降低。(P<0.05)。流式细胞仪分析siBMP-2转染48小时后,SMMC7721-siBMP-2组G0/G1期细胞(59.30%)较空白对照组(32.35%)和阴性对照组(31.08%)细胞明显增加(P<0.05)；S期细胞(22.39%)较空白对照组(35.51%)和阴性对照组(38.32%)细胞明显减少(P<0.05),细胞凋亡率(16.5%)较空白对照组(1.75%)和阴性对照组(1.49%)细胞明显增加(P<0.01)。2、平板黏附模型实验提示SMMC7721-siBMP-2组细胞黏附能力较其它两组明显降低(P<0.01)。细胞划痕实验结果显示细胞划痕宽度分别为SMMC7721-siBMP-2组65.8±5.3μm,空白对照组36.6±4.0μm,阴性对照组34.1±5.1μm,提示SMMC7721-siBMP-2组细胞迁移能力显著降低,其细胞划痕宽度与其它两组相比较,差异有显著意义(P<0.01)。Matrigel体外侵袭实验(transwell侵袭小室模型)结果显示SMMC7721-siBMP-2组、空白对照组和阴性对照组细胞穿膜数分别为11.5±2.0、33.5±3.1和35.7±3.4,提示BMP-2-siRNA沉默BMP-2基因后,肝癌SMMC7721细胞的穿膜数明显降低,即细胞侵袭能力明显降低,与空白对照组、阴性对照组细胞比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论：通过siRNA抑制BMP-2基因的表达,在体外可以显著抑制肝癌SMMC7721细胞的增殖、黏附、迁移和侵袭能力。第五部分siRNA抑制BMP-2表达对肝癌SMMC7721细胞增殖和侵袭影响的机制目的：探讨siRNA抑制BMP-2表达对肝癌SMMC7721细胞体外增殖和侵袭影响的机制。方法：用BMP-2-siRNA转染肝癌SMMC7721细胞48h后,用Western blot检测p-ERK、p-JNK、p-p38蛋白表达水平；分别用RT-PCR、Western blot及明胶酶谱法检测MMP-2、MMP-9、E-Cad以及uPA的表达水平及活性。结果：RT-PCR和Western blot显示BMP-2-siRNA转染肝癌SMMC7721细胞48之后,p-ERK蛋白表达水平明显降低,p-JNK、p-p38蛋白表达水平无明显变化。MMP-2、MMP-9mRNA和蛋白表达均显著下调,明胶酶谱分析显示细胞分泌活性形式的MMP-2、MMP-9也明显减少。E-CadmRNA和蛋白表达均明显上调,而uPAmRNA和蛋白表达则无明显变化。结论：BMP-2-siRNA抑制肝癌SMMC7721细胞增殖和侵袭能力可能是通过MAPK/ERK信号传导通路下调MMP-2、MMP-9和上调E-钙粘蛋白的表达得以实现,而与MAPK/JNK、MAPK/p38信号传导通路和uPA表达无关。