背景： 当前，阻碍器官移植发展的两个主要障碍是免疫排斥和移植物的缺血再灌注损伤。在器官移植前将外源性的目的基因转入移植物，以期表达的功能性蛋白可以缓解免疫排斥反应和缺血再灌注损伤，这是移植领域的一种新的设想，其前景十分诱人。有效的基因治疗方案需要将目的基因稳定、高效地转入移植物的实质和／或非实质细胞，并能产生功能蛋白。病毒载体，特别是复制缺陷性的腺病毒载体在这方面具有天然的优势，因为他能转染处于非增殖期的实质细胞。尽管重组腺病毒载体介导的基因表达有一定的时限性，但对于术后移植物的急性损伤(例如IRI、超排)，14-28天的表达时间是足够的。 第一部分： 目的：用改良双袖套法建立稳定的大鼠原位肝脏移植模型。 方法：结合实践，在取肝、受体麻醉、肝上下腔的吻合、围手术期处理等几方面对传统的二袖套法进行改良，共施行大鼠原位肝移植动物实验150例，观察术后并发症及存活率。 结果：经过150例次的训练，建立了稳定的大鼠原位肝脏移植模型。在实验的第三阶段，受体平均无肝期为13分钟，受体手术时间为45分钟，手术成功率为97％，两周存活率为90％。 结论：改良的二袖套法具有无肝期短、手术成功率高、大鼠术后存活时间长的优点，是大鼠原位肝移植的理想术式。 第二部分： 目的：探讨热休克预处理对移植肝的保护作用。 方法：热休克组大鼠在肝移植前48小时行热休克预处理。供肝获取后将其保存在4℃的乳酸钠林格氏液中4小时，二袖套法行原位肝脏移植术。门静脉复流后观测两组受体胆汁分泌情况，术后3小时处死受体大鼠，检测血浆中AST、ALT、LDH水平，切取肝脏组织，免疫组化法检测HSP70、TNF-α、bcl-2的表达，TUNEL法检测肝脏组织中细胞的凋亡水平。另取实验组和对照组观察其术后受体生存率。 结果：热休克预处理48小时后，免疫组化显示实验组肝脏中HSP70表达明显，而对照组则为阴性。术后3小时，实验组胆汁分泌量多于对照组，而AST、ALT、LDH水平明显低于对照组。对照组TNF-α免疫组化染色为阳性，实验组为阴性。实验组凋亡水平明显低于对照组。两组肝脏bcl-2表达水平相近。实验组生存时间明显长于对照组。 结论：热休克预处理可以有效地保护移植肝，缓解长时间冷保存引起地缺血再灌注损伤，改善受体术后肝功能，延长受体存活时间。Ad.CMv一HSP70腺病毒载体的构建及其对大鼠移植肝的保护作用中文提要 第三部分: 日的:构建重组腺病毒载体Ad.CMv-HSP70，将人热休克蛋白70基因置于mCMV启动子控制之卜。 方法:用酶切法将人热休克蛋自70的全一长cDNA插入腺病毒穿梭质粒载体POC3 12一CMV的多克隆位点。鉴定、筛选包含目的基因的正确克隆，将其与腺病毒骨架质粒载体pBGH△E3一起用liPofectamine共转染至293细胞中，使其在293细胞内进行位点特异性重组及包装。用酶切法和PcR法鉴定后，在293细胞中大量扩增，密度梯度离心纯化。 结果:产物经鉴定后为包含有HsP70全长序列的腺病毒载体，HSP7o基因位于其mCMV启动子控制之卜。经扩增纯化后浓度为3.oX10，”p彻ml，共Zml。 结论:O℃酶介导的勿义尸位点特异性重组是一种简单、高效的腺病毒载体构建方法，具有构建速度快、成功率高、准确率高等特点。 第四部分: 目的:观测我们构建的Ad.CMV-HSP70腺病毒载体在大鼠体内的表达及其对大鼠原位肝脏移植中移植肝的保护作用。 方法:术前24小时将Ad.cMv-HsP70通过门静脉注入实验组供体大鼠肝脏，3.oxl了/只。供肝获取后将其保存在40c的乳酸钠林格氏液中4小时，二袖套法行原位肝脏移植术。门静脉复流后观测两组受体胆汁分泌情况，术后3小时处死受体大鼠，检测血浆中AST、ALT、LDH水平，切取肝脏组织，Westem blotting检测HSP70的表达，免疫组化法检测HSP70、TNF一。的表达，TUNEL法检测肝脏组织中细胞的凋亡水平。 结果:westem blotting显示实验组肝脏组织高表达HSP7o，而对照组仅痕量表达。术后3小时，实验组胆汁分泌量多于对照组，而AST、ALT、LDH水平明显低于对照组。免疫组化显示实验组肝脏中HSP70表达明显，而对照组则为阴性。对照组TNF一a免疫组化染色为阳性，实验组为阴性。实验组凋亡水平明显低于对照组。 结论:我们构建的Ad.CMv-HsP70可以在大鼠体内有效表达。经门静脉注射的方法(3 x 109/只)可以有效的将目的基因转染入大鼠肝脏。高表达HsP70的移植肝对缺血再灌注损伤具有较强的耐受能力，其作用机制可能是通过抑制TNF一Q表达、抑制肝细胞的凋亡发生引起的。