卵巢癌(Epithelial Ovarian Cancer,EOC)发病率在妇科恶性肿瘤中列居第三位,但死亡率却占妇科肿瘤首位。由于卵巢癌位置隐匿,早期患者无临床症状,70%～75%的EOC确诊已是晚期。加上EOC耐化疗,易转移复发,5年存活率低于30%。目前针对卵巢癌的标准治疗是手术切除,辅以铂类为主的化疗,然而大部分患者在18个月内复发,并对化疗药转为耐受型,现有的治疗方法不能达到有效缓解的效果。传统方法无力解决这些问题,迫切需要从新的视角去探索出新的治疗方法。肿瘤干细胞(Cancer Stem Cells,CSCs)学说认为:肿瘤是一种含有不同等级的杂合细胞群,其中包括数量极少的增殖较慢的干细胞样的肿瘤起始细胞,快速增殖的前体细胞,及分化的肿瘤细胞组成。占极小比例的这群肿瘤细胞具有"干细胞"的特性,在发育期间能够通过对称性分裂以扩增数量,或者通过非对称性分裂进行自我更新和产生更多不同分化类型的祖细胞和终末肿瘤细胞,在启动肿瘤形成和生长中发挥着决定性的作用。目前大量实验数据证明,除了造血系统以外,许多实体恶性肿瘤,如乳腺、中枢神经系统、前列腺、肺脏、肝脏和结肠等脏器来源的肿瘤组织中均检测到肿瘤干细胞的存在,并且与肿瘤的发生发展、侵袭转移、复发以及产生放化疗抗性密切相关。许多卵巢癌研究还提示,CD33+细胞可以从卵巢癌组织或卵巢癌细胞株中分离,是一群具有肿瘤干细胞特性的细胞亚群;并证明只需少量CD133(+)细胞既可在SCID小鼠体内成瘤;CD133是卵巢癌干细胞重要的膜表面标志物之一。那么,通过剔除卵巢癌细胞中CD133(+)细胞亚群抑制卵巢癌的复发将会是一种崭新的有前景的治疗策略。Bid分子是一个只含有BH3结构域的Bcl-2家族促凋亡分子。在凋亡发生的过程中,Bid分子N-末端附近将被以Caspase-8为主的多种蛋白酶切割产生tBid。通常状况下,全长Bid分子定位于胞浆,当其被Caspase-8切割,去除N末端片段后,截短为15 kD片段的tBid从细胞浆转位到线粒体,通过释放细胞色素C和改变线粒体外膜通透性等机制调节细胞的凋亡。tBid是细胞凋亡通路激活的重要结点分子。因此,最先,我们计划构建并包装由CMV强启动子直接调控表达高效促凋亡分子tBid的腺病毒,但是在包装和扩增重组腺病毒的过程中,CMV启动子强启动的细胞毒性蛋白就已经将包装细胞杀死,无法得到高滴度的重组腺病毒,我们必须建立一个特异性调节tBid过度表达的系统Cre重组酶是一种位点特异性重组酶能介导两个LoxP序列之间的特异性重组,使两个同向排列的LoxP位点之间的DNA缺失反应。而这一特点正是我们所需要的,我们构建了 Ad-CMV-LoxP-Neo-LoxP-tBid病毒,在tBid分子编码区的上游插入一个无关基因表达盒(Neo基因表达盒),在无关基因表达盒的两侧引入一对同向的LoxP位点,阻断了 tBid分子的产生。为确保由tBid分子触发的凋亡事件在卵巢癌干细胞中特异性发生,我们又构建了 Ad-CD133-Cre病毒。在CD133阳性的卵巢癌干细胞中,CD133启动使Cre重组酶表达。当有Cre重组酶存在的时候,侧翼含有同向LoxP位点的无关基因表达盒被去除,两侧的DNA序列自动连接起来。CMV强启动子启动促凋亡分子tBid大量产生,强效诱导CD133阳性卵巢癌细胞的快速凋亡。理论上说,细胞内只要有很少量的Cre酶就足以切割LoxP位点序列。这样一个由肿瘤干细胞特异性启动子调控表达Cre重组酶的腺病毒加上一个由CMV启动子调控表达外源分子的腺病毒构成的双腺病毒表达系统建立成功,在不降低肿瘤干细胞靶向特异性的同时,能够实现高效的杀伤效果。对构建的2个病毒包装、纯化,Ad-CMV-LoxP-Neo-LoxP-tBid 病毒滴度为 1X1010PFU/ml,Ad-CD133-Cre 病毒滴度为1 1X10 PFU/ml。从SKO-3卵巢癌细胞株中分离出CD133(+)卵巢癌细胞培养,获得的CD133(+)细胞培养后纯度为99.97,而CD133(+)细胞在整个SKO-3卵巢癌细胞株中仅含0.94。20MOI的Ad-CD133-Cre与30MOIAd-cmv-Neo-tBid共同感染细胞是我们得到的一个比较适合的感染比例。为了证实构建的重组病毒Ad-CD133-Cre、Ad-cmv-Neo-tBid能有效感染CD133(+)卵巢癌细胞,我们用绿色荧光蛋白基因标记重组病毒,在荧光显微镜下观察不同组别病毒感染的CD133(+)卵巢癌细胞。在对照组,细胞内的荧光活性几乎检测不到;而在感染了病毒的各组CD133(+)卵巢癌细胞内的荧光活性基本相似,明显高于对照组,P<0.001。结果提示我们构建的重组病毒能有效感染CD133(+)卵巢癌细胞。我们用qRT-PCR检测了各组CD133(+)卵巢癌细胞中tBid的mRNA表达水平;用Western blot分析检测了各组CD133(+)卵巢癌细胞中tBid的蛋白表达水平。对照组,感染包装腺病毒组,感染Ad-CD133-Cre或Ad-CMV-LoxP-Neo-LoxP-tBid病毒组细胞内tBid的mRNA表达水平和蛋白表达水平基本相似。而在共同感染Ad-CD133-Cre和Ad-CMV-LoxP-Neo-LoxP-tBid病毒的细胞内,tBid的mRNA表达水平和蛋白表达水平较其他组四明显升高,P<0.001。结果提示:我们构建的双腺病毒表达系统能有效诱导卵巢癌干细胞内tBid的过度表达。我们又用Western blot分析检测了 Cre和tBid在CD133-和CD133(+)卵巢癌细胞中的蛋白表达。在CD133-细胞中,Cre和tBid的蛋白表达都检测不到。而在CD133(+)细胞中,Cre的蛋白表达仅出现在单独或联合感染了 Ad-CD133-Cre病毒的各组卵巢癌细胞中;tBid的蛋白表达仅仅出现在共同感染了Ad-CD133-Cre和Ad-CMV-LoxP-Neo-LoxP-tBid病毒的细胞中。结果提示,构建的重组双腺病毒表达系统对CD133(+)卵巢癌细胞具有特异性。将感染不同病毒的各组细胞在10ng/mL人重组碱性成纤维细胞生长因子和10ng/mL人重组上皮生长因子的无血清培养基中培养。共同感染了 Ad-CD133-Cre和Ad-CMV-LoxP-Neo-LoxP-tBid病毒组的细胞数量较对照组、感染包装腺病毒组、感染Ad-CD133-Cre病毒或Ad-CMV-LoxP-Neo-LoxP-tBid病毒组明显下降。用MTT法检测卵巢癌干细胞的生长发现共同感染Ad-CD133-Cre和Ad-CMV-LoxP-Neo-LoxP-tBid病毒的卵巢癌干细胞的细胞活性与其余组比较,明显抑制,P<0.001,而其余四组之间无明显差别。Transwell法检测卵巢癌干细胞的侵袭性,发现共同感染Ad-CD133-Cre 和 Ad-CMV-LoxP-Neo-LoxP-tBid 病毒的 CD133(+)卵巢癌细胞组下室中细胞数量明显变少,而其余四组中细胞数量无明显区别。将细胞数定量分析,共同感染双病毒的CD133(+)卵巢癌细胞,细胞侵袭性明显下降,P<0.001,其它四组之间的细胞侵袭性无明显区别。用FITC标记的Annexin V/PI双染色法检测CD133(+)卵巢癌细胞凋亡。发现Q2象限(晚期凋亡细胞或坏死细胞)中的细胞密度在共同感染了双病毒的细胞组较其余四组明显增多,进行定量分析后提示细胞凋亡率增高明显,P<0.001,而其余组间无明显差别。众所周知,体内凋亡通路主要由内源凋亡信号通路和外源凋亡信号通路组成。其中,由线粒体功能改变触发的凋亡通路称为内源凋亡信号通路,发挥重要作用。在凋亡信号tBid的刺激下,线粒体跨膜电位降低、膜通透性增强、细胞色素C释放,诱导Apaf-1/Caspase9凋亡诱导复合体产生,通过下游Caspase切割底物级联激活凋亡事件。在此过程中,转入线粒体的tBid对线粒体内的重要凋亡诱导分子细胞色素C发挥至关重要的正向调控作用。我们用Western blot分析检测了各组细胞中的细胞浆及线粒体内细胞色素C,促凋亡蛋白Bax,caspase-3,caspase-9和抑制凋亡蛋白Bcl-2的蛋白表达,再用Image-Pro Plus 6.0软件将上面的实验结果进行量化分析,结果提示感染了我们构建的重组病毒Ad-CD133-Cre 和 Ad-CMV-LoxP-Neo-LoxP-tBid 的 CD133(+)卵巢癌细胞组与其余四组相比线粒体内的细胞色素C水平明显下降而胞浆内的细胞色素C水平明显增多;Bcl-2水平明显下降,Bax水平明显增多;caspase-3,caspase-9水平有所升高。所有实验结果均有统计学意义,P<0.005。其余四组细胞内的相关活性物质水平没有明显差异。我们还用细胞原位TUNEL法从形态学方面对CD133(+)卵巢癌细胞的凋亡进了验证。结果与之前用FITC标记的Annexin V/PI双染色法检测细胞凋亡的结果相一致,在共同感染Ad-CD133-Cre和Ad-CMV-LoxP-Neo-LoxP-tBid病毒的细胞中,存在大量的凋亡细胞,定量分析提示差异有统计学意义,p<0.05,而其余组中凋亡细胞的数量无明显差异。我们检测了构建的病毒在体外环境中是否影响CD133(+)卵巢癌细胞对顺铂的敏感性。对照组、感染了 Ad-CD133-Cre 或 Ad-CMV-LoxP-Neo-LoxP-tBid 病毒组、共同感了染 Ad-CD133-Cre 和 Ad-CMV-LoxP-Neo-LoxP-tBid 病毒组,四组细胞加入10ug/ml顺铂处理后,用MTT检测分析细胞数量,发现前三组细胞数量和空白组相比明显减少,p<0.05,但三组间无明显差异。共同感染Ad-CD133-Cre和Ad-CMV-LoxP-Neo-LoxP-tBid病毒组的细胞数量与前三组比较又有进一步下降,p<0.05。FITC标记的AnnexinV/PI双染色法检测各组细胞凋亡,结果和之前一致,前三组中细胞凋亡的发生率有所增加,和空白组相比,p<0.05,但组间差异不明显。共同感染Ad-CD133-Cre和Ad-CMV-LoxP-Neo-LoxP-tBid病毒组,细胞凋亡的发生率和前三组比较又明显上升,p<0.05。再次用细胞原位TUNEL法进行验证,结果和我们预期的一致。结果量化分析提示前三组中凋亡细胞数和空白组相比明显增加,p<0.05。共同感染病毒组与前三组比较调亡细胞数又明显增加,p<0.05。我们在裸雌鼠右侧腹部皮下注射CD133(+)卵巢癌细胞建立荷瘤裸鼠模型。每三天在瘤体内注射不同组别的病毒,然后用游标卡尺对体内的肿瘤体积进行观测,肿瘤体积用公式length × width2 × π/6计算,制出裸鼠体内肿瘤的生长曲线。观察裸鼠的存活时间,制出裸鼠存活率。发现对照组裸鼠全身水肿明显,腹部膨隆,有腹水存在,肿瘤组织体积较大,边界不清;实验组裸鼠全身无水肿,种植的肿瘤体积较小,边界清晰。当观察到30天的时候,对照组裸鼠全部死亡,而实验组还有近50%的裸鼠存活,两组间差异明显,P<0.05。从肿瘤的生长曲线看:瘤体内仅注射Ad-CD133-Cre或Ad-CMV-LoxP-Neo-LoxP-tBid病毒的裸鼠,肿瘤生长速度与空白组比较无明显区别。而瘤体内注射Ad-CD133-Cre和Ad-CMV-LoxP-Neo-LoxP-tBid病毒的实验组肿瘤的生长速度明显被抑制,P<0.05。我们切除裸鼠体内的肿瘤组织,用细胞原位TUNNEL法检测了标本的细胞凋亡数。结果显示:对照组,瘤体内仅注射Ad-CD133-Cre或Ad-CMV-LoxP-Neo-LoxP-tBid病毒组,三组裸鼠肿瘤组织内发生凋亡的细胞数基本相同,而瘤体内注射Ad-CD133-Cre和Ad-CMV-LoxP-Neo-LoxP-tBid病毒组,肿瘤组织内发生凋亡的细胞数与前三组比较明显增多,P<0.05。用Wester blot法检测各组裸鼠肿瘤组织中tBid和caspase-3的表达水平,发现caspase-3的表达水平与tBid的表达水平一致。前三组瘤组织中的tBid和caspase-3表达水平基本相同,而在瘤体内注射Ad-CD133-Cre和Ad-CMV-LoxP-Neo-LoxP-tBid病毒组,肿瘤组织内tBid和caspase-3表达水平急剧增多,P<0.05。综上所述,我们构建的肿瘤干细胞特异性双腺病毒调控表达系统在体内、体外实验中都可以特异高效地诱导tBid过度表达,上调细胞内的线粒体凋亡通道,产生大量的促凋亡活性分子,使卵巢癌肿瘤干细胞发生凋亡,能明显延长荷瘤裸鼠的存活期。在体外实验中,我们构建的病毒系统还可以增加卵巢癌肿瘤干细胞对顺铂的敏感性。我们的研究或许可以给卵巢癌的治疗提供了一种崭新的治疗策略。