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背景：2012年6月，在一位沙特阿拉伯人身上首次发现一种类似于急性严重呼吸综合征冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome, SARS-CoV)的病毒，随即其便证明并命名为中东呼吸道综合征冠状病毒(Middle East Resperatorysyndrome, MERS-CoV)。据世界卫生组织统计，截止2014年2月28日，MERS-CoV已感染184例，其中80例死亡，死亡率近45%。MERS-CoV基因组由正义、单链RNA组成，且其编码的两个大复制酶多聚蛋白pp1a和pp1ab主要是由基因组前2/3部分翻译得到。pp1a和pp1ab被木瓜样蛋白酶(Papain-like protease, PLpro)和3C样蛋白酶(Chymotrypsin-like protease,3CLpro)切割成16个非结构蛋白(nsp1-16)。Nsp1-16经过组装产生一个多功能、膜结合且可以介导完成病毒基因组复制和结构基因转录与翻译的复制酶聚合体(Replicase complex, RC)。区别于已知大多数编码两个木瓜样蛋白酶(PLP1和PLP2)的冠状病毒是，MERS-CoV仅编码一个木瓜样蛋白酶，PLpro。MERS nsp3编码7个小的功能结构域，其中以PLpro为核心，且PLpro C端TM跨膜结构域将其定位于膜上。MERS-CoV感染出现后，其便成为医学界研究的焦点和生物学界研究热点之一，本实验室率先针对MERS-CoV蛋白酶的结构学特征和生物学功能展开深入研究。目的：以人类MERS-CoV带跨膜结构域的木瓜样蛋白酶PLpro-TM为研究对象，MERS PLpro高级结构、具体生物学功能以及其对宿主细胞内IFN表达调控的研究，为进一步探究人类新冠状病毒MERS的致病机理提供理论依据和新抗病毒药物的研发提供靶点。方法：首先，人工合成MERS-CoV PLpro-TM和各个酶切底物nsp1-2, nsp2-3和nsp3-4。其次，利用PCR技术克隆得到不含跨膜结构域的MERS PLpro，并利用PCR定点突变试剂盒将PLpro-TM/PLpro蛋白酶催化活性中心Cys-His-Asp分别突变为Ala，从而构建出三种酶活性缺失突变体；同时构建出各个蛋白酶酶切底物的LXGGA相应突变体。最后，利用蛋白印迹法、双荧光素酶报告基因和免疫荧光染色技术检测MERS PLpro-TM的生物学功能及其对宿主细胞内IFN表达调控。对其机制进行进一步研究，首先利用Western blot技术检测MERS-CoVPLpro-TM对不同蛋白酶底物的切割情况，并利用PCR定点突变技术构建PLpro-TM/PLpro酶活性突变体及蛋白酶底物点突变体，利用Western blotting技术检测突变体对PLpro-TM酶活性影响及突变体对蛋白酶底物切割的影响。其次，双荧光素报告基因检测MERS PLpro-TM/PLpro及其蛋白酶催化活性突变体对宿主细胞内IFN表达调控；Western blotting检测MERS PLpro-TM对细胞内IRF3磷酸化水平影响；间接免疫荧光技术检测MERS PLpro-TM对细胞内IRF3入核活化的影响情况。最后Western blotting检测MERS PLpro-TM/PLpro对细胞内泛素化水平的影响。结果：1. MERS PLpro-TM高级空间结构研究：以SARS PLpro蛋白酶为预测模板，利用生物信息学预测MERS PLpro高级空间结构。结果显示，MERS-CoVPLpro与SARS-CoV PLpro及两者的蛋白酶催化活性位点的高级空间结构存在一定程度的相似性。2. MERS PLpro-TM特异性地切割释放底物蛋白:在HEK293T细胞中，MERSPLpro-TM可以完全切割释放蛋白酶底物nsp2-3，部分切割释放底物nsp1-2和nsp3-4。分别突变MERS PLpro-TM的各个蛋白酶催化活性中心后，发现各个蛋白酶底物的切割释放产物量均有所降低。此外，实验结果显示当底物蛋白酶的高度保守序列被突变后，PLpro-TM对底物蛋白酶的切割释放明显减弱。提示MERS-CoV PLpro-TM特异性识别并切割底物蛋白酶的高度保守序列，且此切割作用受PLpro-TM蛋白酶催化活性位点影响。3. MERS PLpro-TM是人类冠状病毒编码的一种新IFN拮抗蛋白：在HEK293T细胞中，MERS PLpro-TM及其一系列蛋白酶活性突变体均可抑制RIG-IN介导的细胞内IFN表达，并通过破坏细胞内IRF3磷酸化进而破坏IRF3通路的活化，暗示着MERS-CoV PLpro-TM主要通过破坏细胞内IRF3通路的活化从而抑制干扰素表达。4. MERS PLpro-TM是人类冠状病毒编码的一种新DUB酶：将泛素分子(HA-Ub，HA-Ub K48，HA-Ub K63)分别与MERS PLpro/PLpro-TM基因共同转入HEK293T细胞，发现MERS PLpro/PLpro-TM能有效地去除细胞内泛素化修饰的蛋白(包括K63、K48修饰的泛素化)，从而证实MERS PLpro-TM/PLpro具有细胞内DUB活性，且PLpro的DUB活性存在蛋白酶催化活性依赖性，然而MERSPLpro-TM不存在此种依赖性。提示MERS PLpro的蛋白酶活性与其DUB活性存在必然联系，且MERS PLpro-TM的DUB活性呈现一定程度的TM依赖性。结论：MERS-CoV编码的木瓜样蛋白酶PLpro-TM通过识别高度保守序列LXGG完成对蛋白酶底物的特异性切割，且此活性主要依赖于其蛋白酶催化活性中心；同时MERS-CoV PLpro是一种新的干扰素拮抗蛋白，其可能通过破坏细胞内IRF3的磷酸化并阻断其入核，从而抑制细胞内干扰素的表达；此外，MERSPLpro-TM能够有效去除细胞内蛋白的泛素化，是人类冠状病毒编码的一种新DUB酶。